补虚活血中药枸杞子丹参对rd10 小鼠视网膜TNF-α、IL-1β 表达的影响

蒋鹏飞 姚 震▲ 欧 晨 杨毅敬 彭 俊 徐 剑 彭清华▲

1.湖南中医药大学中医学院，湖南长沙 410208；2.湖南省中医药防治眼耳鼻咽喉疾病与视功能保护工程技术研究中心，湖南长沙 410208；3.湖南中医药大学第一附属医院眼科，湖南长沙 410007；4.上海市东方医院眼科，上海 200120

视网膜色素变性（retinitsi pigmentosa，RP）是一种眼科常见的难治性遗传性视网膜疾病[1-3]，发病隐匿，多数患者在40 岁左右便丧失有用视力。小胶质细胞是中枢神经系统的免疫细胞，具有抗原提呈、吞噬消化和免疫调节等作用[4-6]，活化的小胶质细胞在一些中枢神经系统的急性损伤中具有促进神经元存活的作用，而在一些慢性损伤中作用却相反[7-10]。RP 存在神经节细胞的死亡，而这种死亡极有可能由小胶质细胞介导，肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）是小胶质细胞活化的关键靶点，本研究通过检测rd10 小鼠视网膜中TNF-α、IL-1β 的表达，以期能明确补虚活血中药枸杞子丹参对RP 的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

枸杞中药超微配方颗粒规格为3 g/袋（相当于临床成人中药配方使用量10 g），许可证号：湘20150006，批号：190247，湖南春光九汇现代中药有限公司生产；丹参中药超微配方颗粒：规格为2.8 g/袋（相当于临床成人中药配方使用量10 g），许可证号：湘20150006，批号：190131，湖南春光九汇现代中药有限公司生产；维生素A 软胶囊（批号：140701，青岛双鲸药业有限公司生产）。

1.2 实验动物

C57 种系Pde6b 基因突变（Pde6b，-/-）rd10 小鼠40 只，鼠龄4 周，体重18～20 g，购自美国JAX 实验室，证书编号：NO.1911A11353；C57 野生型（Pde6b，+/+）小鼠8 只，鼠龄4 周，体重20～22 g，由湖南斯莱克景达动物实验室提供，证书编号：NO.43004700062254。实验经湖南斯莱克景达动物实验室伦理审批。

1.3 主要试剂仪器

TNF-α 抗体（abcam 公司，货号：ab183218）；IL-1β抗体（abcam 公司，货号：ab254360）；RIPA 裂解液（中国上海碧云天，货号：P0013B）；mRNA 逆转录试剂盒（中国北京康为世纪生物科技有限公司，货号：CW2569）。摇床（江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司，型号：TS-92）；恒温箱（北京六一生物科技有限公司，型号：DYY-6C）；精密pH 计（上海仪电科学仪器股份有限公司，型号：E-201-C）。

1.4 分组方法

将40 只rd10 小鼠按照随机数字表法分为五组，每组8 只，分别为模型组、对照组、枸杞组、丹参组、杞参组。8 只C57 野生型小鼠为空白组。每组雌雄鼠分开饲养。

1.5 给药方法

所有小鼠在SPF 级动物房进行适应性饲养1 周后给予灌胃处理，灌胃28 d，灌胃剂量为20 ml/（kg·d），每天灌胃1 次。模型组和空白组灌胃生理盐水，对照组灌胃维生素A 溶剂，枸杞组灌胃枸杞子中药配方颗粒溶液，丹参组灌胃丹参中药配方颗粒溶液，杞参组灌胃枸杞子加丹参中药配方颗粒溶液。

1.6 取材方法

灌胃结束后第1 天取材，取材前禁食12 h。10%水合氯醛3 ml/kg 腹腔注射麻醉动物，75%酒精消毒rd10 小鼠双眼眼周，用眼科弯组织剪摘除眼球，保存于-80℃冰箱中，供Western blot 及实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）检测。

1.7 观察指标及检测方法

1.7.1 RT-qPCR 法检测TNF-α、IL-1β mRNA 相对表达量①提取RNA。将分离好的视网膜约0.02 g 与1 ml Trizol 置于匀浆器充分研磨、混匀，12 000 r/min 离心15 min，离心半径为95 mm，弃上清，晾干后加入无菌无酶水，待沉淀完全溶解，取2 μl 溶液用于RNA 浓度和纯度检测。②逆转录RNA，反应体系（表1）。③RTqPCR 实验，从NCBI 获取目的基因序列（表2），采用primer5 软件设计引物。

表1 逆转录反应体系（30 μl）

表2 目的基因序列

1.7.2 Western blot 法检测TNF-α、IL-1β 蛋白灰度值 ①蛋白样本提取：将视网膜组织与RIPA 裂解液一同充分研磨，离心后取上清。②制胶。③电泳。④转膜：打开转膜夹，按顺序铺好滤纸、NC 膜和胶，清除气泡。启动仪器，恒流300 mA。⑤封闭：将转好的膜取出漂洗，浸入配置好的封闭液中静置90 min。⑥孵育一抗（表3）。⑦孵育二抗（表4）。每次孵育结束后，1×PBST 洗涤10 min，重复3 次。⑧显影：将膜转入ECL 化学发光试剂中孵育1 min，然后吸尽发光液，塑封膜包裹杂交膜，暗盒中X 胶片曝光、显影。⑨扫描底片，用quantity one 软件分析灰度。

表3 一抗信息

表4 二抗信息

1.8 统计学方法

采用SPSS 21.0 软件对所得数据进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，组间两两比较采用t 检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用LSD-t 分析。计数资料采用例数或百分率表示，组间比较采用χ2检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠视网膜TNF-α、IL-1β mRNA 相对表达量

与空白组比较，模型组TNF-α、IL-1β mRNA相对表达量升高（P ＜0.05），与模型组比较，枸杞组、丹参组、杞参组TNF-α、IL-1β mRNA 相对表达量降低（P ＜0.05），与枸杞组比较，杞参组IL-1β mRNA相对表达量降低（P ＜0.05），与丹参组比较，杞参组TNF-α、IL-1β mRNA 相对表达量降低（P ＜0.05）。见表5。

表5 各组TNF-α、IL-1β mRNA 相对表达量比较（）

表5 各组TNF-α、IL-1β mRNA 相对表达量比较（）

注：与空白组比较，aP ＜0.05；与模型组比较，bP ＜0.05；与枸杞组比较，cP ＜0.05；与丹参组比较，dP ＜0.05。TNF-α：肿瘤坏死因子-α；IL-1β：白细胞介素-1β

2.2 各组小鼠视网膜TNF-α、IL-1β 蛋白相对表达量

与空白组比较，模型组TNF-α、IL-1β 蛋白相对表达量升高（P ＜0.05），与模型组比较，枸杞组、丹参组、杞参组TNF-α、IL-1β 蛋白相对表达量降低（P ＜0.05），与枸杞组比较，杞参组TNF-α、IL-1β 蛋白相对表达量降低，与丹参组比较，杞参组TNF-α、IL-1β蛋白相对表达量降低（P ＜0.05）。见图1、表6。

图1 各组小鼠视网膜目的蛋白表达条带图

表6 各组TNF-α、IL-1β 蛋白平均灰度值比较（）

表6 各组TNF-α、IL-1β 蛋白平均灰度值比较（）

注：与空白组比较，aP ＜0.05；与模型组比较，bP ＜0.05；与枸杞组比较，cP ＜0.05；与丹参组比较，dP ＜0.05。TNF-α：肿瘤坏死因子-α；IL-1β：白细胞介素-1β

3 讨论

古今医家对RP“虚”的病机认识较为一致[11]，均认为在RP 病程中始终伴随着“虚损”，彭清华教授率先在国内论证了RP 患者存在虚中夹瘀之证。针对RP 虚中夹瘀的病机，彭清华教授提出以补虚活血法治疗RP，前期研究发现补虚活血中药能诱导RP 动物模型视网膜αB 多肽mRNA 的表达，抑制凋亡相关靶点的表达，进而减少RP 动物模型视网膜感光细胞凋亡，保护视网膜超微结构[12-17]。

实验研究表明[18-22]，枸杞子能够通过抗氧化、抗衰老、抗凋亡作用机制起到保护视细胞及视网膜色素上皮细胞的作用。丹参大量应用在与眼底血管相关性疾病的治疗中，有研究表明其在减轻视网膜色素上皮光损伤、抑制视网膜色素上皮细胞炎症增殖等方面也有一定的作用[23]。

大量研究表明小胶质细胞的迁移活化与视细胞凋亡密切相关[24-25]，而TNF-α 和IL-1β 是小胶质细胞活化的关键靶点，也是促凋亡因子。本研究显示，与空白组野生型小鼠比较，rd10 小鼠视网膜TNF-α、IL-1β 蛋白及mRNA 的表达明显增高，TNF-α、IL-1β 可能是RP 病变中的关键分子靶点。本研究以补虚活血代表性药物枸杞子丹参干预rd10 小鼠，发现枸杞子丹参能明显抑制rd10 小鼠视网膜中TNF-α、IL-1β蛋白及mRNA 的表达，虽然枸杞子与丹参也能抑制rd10 小鼠视网膜中TNF-α、IL-1β 蛋白及mRNA 的表达，但其效果低于枸杞子与丹参联用，这提示补虚活血法治疗RP 优于单纯补虚法或单纯活血法。

综上所述，补虚活血中药枸杞子丹参治疗RP 的机制可能是通过抑制了小胶质细胞活化的关键靶点TNF-α、IL-1β，但其具体作用的上下游基因及通路仍然不明确，今后在对补虚活血中药枸杞子丹参治疗RP的机制研究中，可着重观察其对小胶质细胞的影响，以了解其机制。