P22phox通过调节KLF4的表达对缺氧诱导的肺动脉平滑肌细胞的作用*

古丽那扎尔 李倩 米娜瓦尔·胡加艾合买提 吴雷琪 阿加尔古丽·依米提

(新疆医科大学第一附属医院全科医学科，新疆 乌鲁木齐 830054)

1 材料与方法

1.1 主要材料 人肺动脉平滑肌细胞(Human pulmonary artery smooth muscle cells，HPASMCs)购自宁波明舟生物科技有限公司；平滑肌细胞专用培养基购自北京裕恒丰科技有限公司；P22phox siRNA序列(si- P22phox)、siRNA阴性对照(si-NC)、KLF4过表达载体(oe- KLF4)及其阴性对照(oe-NC)购自武汉金开瑞生物工程有限公司；LipofectamineTM2000转染试剂购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；CCK-8试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；EdU细胞增殖检测试剂盒购自上海索莱宝生物科技有限公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)购自宝日医生物技术(北京)有限公司；2xSYBR Green qPCR MasterMix购自美国Bimake；P22phox抗体和KLF4抗体购自英国Abcam；GAPDH抗体购自美国GeneTex。

1.2 细胞培养及缺氧处理 将冻存的HPASMCs取出，37℃温水快速解冻，800 rpm离心3 min后，弃去细胞上清液。含10% FBS的平滑肌细胞专用培养基重悬细胞沉淀，并将细胞悬液转移至培养皿中，常氧组细胞置于37℃、21% O2、5% CO2、74% N2培养箱中培养。缺氧组细胞置于37℃、3% O2、5% CO2、92% N2培养箱中培养。收集常氧培养的细胞及缺氧处理24 h的细胞进行后续实验操作。

1.3 细胞转染 将对数期生长的HPASMCs接种于6孔细胞培养板中，其中每孔细胞数量为5×105个。细胞于常氧条件下继续培养24 h后，弃去细胞旧培养基，重新添加含10% FBS的平滑肌细胞专用培养基，将细胞随机分为空白对照组(不进行转染操作)、si-NC+oe-NC组(转染si-NC和oe-NC)、si-P22phox+oe-NC组(转染si-P22phox和oe-NC)和si-P22phox+oe-KLF4组(转染si-P22phox和oe-KLF4)，根据LipofectamineTM2000转染试剂说明书进行转染操作。细胞继续培养48 h后，将细胞置于缺氧条件下培养24 h，随后进行后续实验操作。

1.4 CCK-8实验检测细胞活力 将对数期生长的HPASMCs接种于96孔细胞培养板中，其中每孔细胞数量为5×103个。细胞继续培养24 h后，根据1.3所示进行转染操作，转染48 h后，细胞置于缺氧条件下培养24 h。随后根据CCK-8试剂盒说明书所示，向每孔细胞中加入10 μL CCK-8溶液，细胞置于37℃培养箱中孵育4 h。用酶标仪测定各孔在450 nm处的光密度(OD)值。

1.5 EdU实验检测细胞增殖能力 将对数期生长的HPASMCs接种于96孔细胞培养板中，其中每孔细胞数量为5×103个。细胞继续培养24 h后，根据1.3所示进行转染操作，转染48 h后，细胞置于缺氧条件下培养24 h。弃去细胞旧培养基，加入50 μmo/L EdU的培养基37℃孵育2 h。4%多聚甲醛室温固定细胞30 min。2 mg/mL的甘氨酸，室温孵育5 min，PBS清洗细胞。0.5% TritonX-100室温孵育10 min后，PBS清洗细胞。加入1×Apollo染色反应液，室温避光孵育30 min后，弃去反应液，加入0.5% TritonX-100清洗细胞，DAPI染核。荧光显微镜观察细胞发光情况。红色荧光为EdU阳性着色，蓝色荧光为DAPI阳性着色。

1.6 细胞划痕实验检测细胞迁移 将对数期生长的HPASMCs接种于6孔细胞培养板中，其中每孔细胞数量为5×105个。按照1.3所示进行转染操作，转染48 h后，用枪头沿着直尺垂直于培养板划线，PBS清洗细胞，重新加入无血清平滑肌细胞专用培养基，显微镜观察并拍照，此为0 h图片。细胞置于缺氧条件下培养24 h后，显微镜观察并拍照，此为24 h图片。Image J软件分析细胞划痕面积，细胞划痕愈合率(%)=(1-划痕面积24 h/划痕面积0 h)×100%。

1.7 Transwell实验检测细胞迁移 将Transwell小室放入24孔培养板中。无血清平滑肌细胞专用培养基重悬HPASMCs，取2×104个HPASMCs接种于Transwell小室中，下室加入800 μL含10% FBS的平滑肌细胞专用培养基。细胞置于缺氧条件下培养24 h后，取出小室，800 μL 4%多聚甲醛室温固定30 min。1%结晶紫染液室温染色20 min。PBS清洗细胞，显微镜观察计数。

1.8 qRT-PCR检测细胞P22phox和KLF4 mRNA表达 收集转染后的HPASMCs，Trizol法提取细胞总RNA。根据PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)说明书所示，将提取的RNA进行反转录操作，得到cDNA。按照2xSYBR Green qPCR MasterMix使用说明书所示，进行qRT-PCR实验。qRT-PCR反应程序为：95℃ 2 min；95℃ 15 s，58℃ 15 s，72℃ 30 s，40个循环；72℃ 5 min。以GAPDH mRNA表达量为内参，采用2-ΔΔCt法计算P22phox和KLF4 mRNA表达。实验所需引物见表1。

表1 qRT-PCR实验所需引物序列

1.9 Western blot检测细胞P22phox和KLF4蛋白表达 收集转染后的HPASMCs，加入蛋白裂解液重悬细胞，冰上裂解细胞30 min。12000 rpm离心20 min收集细胞上清液，BCA法测定上清液蛋白浓度。取25 μg蛋白加入加样孔中，进行SDS-PAGE电泳。电泳结束后，进行转膜操作，将凝胶中的蛋白转印至PVDF膜上，5% BSA室温孵育2 h。加入P22phox抗体(1∶2000)、KLF4抗体(1∶1000)和GAPDH抗体(1∶2000)，4℃条件下孵育过夜。加入特异性二抗(1∶5000)室温孵育1 h。PVDF膜经清洗后，向膜上均匀滴加ECL发光液，暗室曝光。以GAPDH为内参，应用Image J软件对蛋白条带进行灰度分析。

2 结果

2.1 缺氧对PASMCs增殖的影响 CCK-8实验和EdU实验检测细胞活力和增殖能力，结果显示，与常氧组相比，缺氧组细胞活力显著升高，EdU+细胞数显著升高(均P<0.05)，见图1。

图1 缺氧对肺动脉平滑肌细胞增殖的影响

2.2 缺氧对PASMCs迁移的影响 细胞划痕实验和Transwell实验检测细胞迁移，结果显示，与常氧组相比，缺氧组细胞划痕愈合率显著升高，迁移细胞数显著升高(均P<0.05)，见图2。

图2 缺氧对PASMCs迁移的影响

2.3 缺氧对PASMCs中P22phox和KLF4表达的影响 qRT-PCR和Western blot检测细胞中P22phox和KLF4表达，结果显示，与常氧组相比，缺氧组细胞中P22phox和KLF4 mRNA表达显著升高，P22phox和KLF4蛋白表达显著升高(均P<0.05)，见图3。

图3 缺氧对肺动脉平滑肌细胞P22phox和KLF4表达的影响

2.4 敲低P22phox对缺氧肺动脉平滑肌细胞中KLF4表达的影响 qRT-PCR和Western blot检测细胞中P22phox和KLF4表达，结果显示，与空白对照组相比，si-NC+oe-NC组细胞P22phox和KLF4 mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)，P22phox和KLF4 蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)；与si-NC+oe-NC组相比，si-P22phox+oe-NC组细胞P22phox和KLF4 mRNA表达显著降低，P22phox和KLF4 蛋白表达显著降低(均P<0.05)；与si-P22phox+oe-NC组相比，si-P22phox+oe-KLF4组细胞P22phox mRNA和蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)，KLF4 mRNA和蛋白表达显著升高(P<0.05)，见图4。

图4 敲低P22phox对缺氧肺动脉平滑肌细胞中KLF4表达的影响

2.5 P22phox/ KLF4轴对缺氧肺动脉平滑肌细胞增殖的影响 CCK-8实验和EdU实验检测细胞活力和增殖能力，结果显示，与空白对照组相比，si-NC+oe-NC组细胞活力表达差异无统计学意义(P>0.05)，EdU+细胞数差异无统计学意义(P>0.05)；与si-NC+oe-NC组相比，si-P22phox+oe-NC组细胞活力显著降低，EdU+细胞数显著降低(均P<0.05)；与si-P22phox+oe-NC组相比，si-P22phox+oe-KLF4组细胞活力显著升高，EdU+细胞数显著升高(均P<0.05)，见图5。

图5 P22phox/ KLF4轴对缺氧肺动脉平滑肌细胞增殖的影响

2.6 P22phox/ KLF4轴对缺氧肺动脉平滑肌细胞迁移的影响 细胞划痕实验和Transwell实验检测细胞迁移，结果显示，与空白对照组相比，si-NC+oe-NC组细胞划痕愈合率和迁移细胞数差异无统计学意义(P>0.05)；与si-NC+oe-NC组相比，si-P22phox+oe-NC组细胞划痕愈合率和迁移细胞数显著降低(P<0.05)；与si-P22phox+oe-NC组相比，si-P22phox+oe-KLF4组细胞划痕愈合率和迁移细胞数显著升高(P<0.05)，见图6。

图6 P22phox/ KLF4轴对缺氧肺动脉平滑肌细胞迁移的影响

3 讨论

PAH血管功能障碍的主要特征包括血管收缩、血管壁重塑和原位血栓形成，从而导致肺血管阻力增加。血管病变主要通过内膜增生、中膜肥大、外膜增生、炎症、血栓形成和丛状病变的发展影响远端肺动脉[7]。缺氧诱导的PASMCs的过度增殖和迁移被认为是干预PAH相关血管重塑的一个有前途的靶点[8-9]，因此有必要研究PASMCs增殖和迁移相关的分子机制，以期为开发PAH治疗靶点提供新的科学资料。

内皮细胞和其他血管细胞中的超氧化物歧化酶和过氧化氢等活性氧的一个主要来源是NOX家族。这个蛋白家族的第一个成员NOX2与P22phox一起形成细胞色素b558，作为NOX的催化核心[10]。目前的研究结果表明，对氧磷可通过上调血管中P22phox的表达导致血管内皮功能障碍[11]。Pena等[12]的研究结果显示，慢性间歇性低压缺氧可诱导大鼠心肌组织中P22phox表达上调， P22phox可能在缺氧诱导的相关病理生理过程中发挥重要作用。已有相关的证据显示，P22phox在缺氧条件下可促进人微血管内皮细胞增殖、迁移和血管生成。体内实验结果显示，低氧诱导的PAH小鼠肺和心脏组织中P22phox表达增加，而敲低P22phox对低氧诱导的PAH小鼠具有保护作用[13]。此外，Nagaraj 等[14]的研究结果显示，在慢性阻塞性肺疾病患者中，P22phox的表达与平均肺动脉压、氧合指数呈正相关。在慢性缺氧环境下，P22phox缺失与右心室功能改善和肺血管重塑减少有关。本研究结果显示，缺氧可诱导HPASMCs增殖和迁移，还可上调细胞中P22phox的表达。进一步实验结果显示，敲低P22phox可抑制缺氧诱导的HPASMCs增殖和迁移。该研究结果表明，P22phox可促进缺氧条件下HPASMCs增殖和迁移，可能是治疗PAH肺动脉重塑的重要靶点。

KLF4与许多重要的细胞过程有关，如细胞增殖、分化和炎症等其他生物学活动[15]。以前的研究已经证明，KLF4参与调控血管平滑肌细胞表型转化，并能促进细胞增殖和迁移能力[16]。下调细胞中KLF4的表达可抑制血管平滑肌细胞异常增殖和迁移[17-18]。目前，已有证据显示，长期缺氧可导致血管平滑肌细胞增殖速度大于凋亡，最终导致不可逆的肺血管重塑[19]。而在缺氧条件下血管平滑肌细胞中KLF4表达增加，敲低KLF4可抑制血管平滑肌细胞的迁移[20]。目前，已有相关研究证明，KLF4在香烟烟雾提取物诱导的PAH大鼠的肺动脉中表达上调，敲低KLF4可以预防和改善大鼠PAH的进展[21]。本研究结果显示，缺氧诱导的HPASMCs中KLF4表达上调。另外，已有研究表明，敲低P22phox通过下调KLF4表达抑制血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞增殖和迁移[22]。本研究结果显示，在缺氧诱导的HPASMCs中，敲低P22phox可下调细胞中KLF4表达。进一步实验结果表明，过表达KLF4可逆转敲低P22phox对缺氧HPASMCs的作用，促进HPASMCs增殖和迁移。本研究结果还表明，P22phox可通过上调KLF4表达促进缺氧条件下HPASMCs增殖和迁移，P22phox/ KLF4轴可能是治疗PAH肺动脉重塑的重要靶点。

4 结论

本研究结果显示，缺氧可诱导HPASMCs增殖和迁移，还可上调HPASMCs中P22phox和KLF4的表达。P22phox可通过上调KLF4表达促进缺氧条件下HPASMCs增殖和迁移。该研究结果为明确PAH血管重塑分子机制及开发新的PAH治疗靶点提供了新的科学依据。