miR-16-5p靶向PTEN/PI3K/AKT信号通路对非小细胞肺癌细胞活性和迁移能力的影响*

2022-01-20陈民彪蔡仁中黄明芳黄修明廖绪强

西部医学 2022年1期

陈民彪蔡仁中黄明芳黄修明廖绪强

(海南省人民医院·海南医学院附属海南医院胸外科，海南海口 570311)

肺癌是常见的恶性肿瘤之一，以非小细胞肺癌(Non-samll cell lung cancer，NSCLC)发病率最高，占肺癌发病率的80%以上[1-3]。目前，NSCLC的临床治疗主要以手术切除、化疗、放疗为主，但预后不理想[4-6]。MicroRNA(miRNA)是一类内源性表达的非编码小分子RNA，长度约为22个核苷酸，能通过与靶基因相互作用调节基因表达，其失调涉及癌细胞的各个方面，包括细胞的生长、凋亡、增殖、迁移和侵袭等过程[7-8]。蛋白酪氨酸磷酸酶基因(PTEN)是近年被发现的包括NSCLC在内的各种癌症类型中众所周知的肿瘤抑制因子，通过介导磷脂酰肌醇-3-激酶(Phosphatidylinositol-3-kinase, PI3K)/丝氨酸-苏氨酸激酶(Protein kinase B, AKT)信号通路的活化，与癌症进展密切相关[9]。miR-16-5p在NSCLC中低表达，其被认为是NSCLC的抑癌基因。因此，本研究旨在探讨NSCLC中低表达的miR-16-5p对A549细胞活性、迁移和PTEN/PI3K/AKT信号通路的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞株和主要材料人源性NSCLC A549细胞株购自中科院上海细胞库；TRIzol和LipofectamineTM2000转染试剂购自Invitrogen公司(美国)；AS-miR-16-5p及miR-NC序列的设计合成委托上海康成生物工程有限公司(中国)；含双抗的RPMI 1640培养基购自Invitrogen公司(美国)；胎牛血清购自Hyclone公司(美国)；MTT试剂购自Sigma公司(美国)；Transwell小室购自Millipore公司(美国)；PTEN抗体、p-AKT抗体PI3K抗体购自Invitrogen公司(美国)。

1.2 细胞培养 A549细胞培养于含10%胎牛血清RPMI 1640培养基中，置于37 ℃、5% CO2的培养箱内培养并进行传代。取传代后对数期细胞用于后续实验。

1.3 细胞转染收集A549细胞接种于6孔板中，分为Blank组、miR-NC组和AS-miR-16-5p组。根据LipofectamineTM2000说明书，在无血清RPMI 1640培养基中转染miR-NC和AS-miR-16-5p质粒。在转染6 h后，培养基替换为含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养48 h。收获细胞用于qRT-PCR分析。

1.4 qRT-PCR检测 TRIzol试剂提取细胞mRNA，根据反转录试剂盒步骤合成cDNA，然后扩增目的基因，检测miR-16-5p表达水平。

1.5 MTT检测将每组A549细胞以每孔2×104个细胞接种在96孔板，置于37 ℃培养箱中分别培养至24、48、72、96 h，然后小心弃掉上清液。每孔中加入20 μL MTT溶液，并在培养箱中孵育4～6 h，然后小心弃掉上清液。每孔中加入150 μL DMSO溶液，避光震荡10 min，通过酶标仪测定A549细胞在570 nm波长时的吸光度(OD值)。

1.6 细胞划痕实验将每组A549细胞接种于6孔板，待细胞融合度达到90%时，使用无菌移液器在细胞上进行垂直刮擦，然后将培养板用PBS洗涤2次，然后加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养24 h后拍照。

1.7 Transwell实验将每组A549细胞接种于24孔板中Transwell上室中，将500 μL含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基加入下室中，37℃培养箱中培养细胞24 h。4%多聚甲醛固定后去除上室细胞，用0.1%结晶紫染色，通过酶标仪测定A549细胞在570 nm波长时的吸光度(OD值)。

1.8 蛋白质印迹法收集每组A549细胞并用PBS洗涤3次。RIPA裂解缓冲液提取细胞的总蛋白，并通过BCA法进行蛋白定量。对总蛋白(25 μg蛋白/泳道)进行SDS-PAGE凝胶电泳，然后将蛋白转移到PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭2 h。将膜与一抗在4℃孵育过夜，然后与二抗在室温孵育1 h。使用ECL发光剂显影并通过软件进行定量。

2 结果

2.1 AS-miR-16-5p对NSCLC A549细胞miR-16-5p表达水平的影响与Blank组、miR-NC组相比，AS-miR-16-5p组miR-16-5p表达水平下降(P<0.05)；Blank组与miR-NC组相比，差异无统计学意义(P>0.05)；表明AS-miR-16-5p抑制miR-16-5p在NSCLC A549细胞的表达，见图1。

图1 AS-miR-16-5p对NSCLC A549细胞miR-16-5p表达水平的影响

2.2 AS-miR-16-5p对NSCLC A549细胞活性的影响与Blank组、miR-NC组比较，AS-miR-16-5p组细胞活性降低(P<0.05)；Blank组与miR-NC组比较，差异无统计学意义(P>0.05)；表明AS-miR-16-5p显著抑制NSCLC A549细胞的活性，见图2。

图2 AS-miR-16-5p对NSCLC A549细胞活性的影响

2.3 AS-miR-16-5p对NSCLC A549细胞迁移能力的影响细胞划痕实验结果显示，经处理24 h后，AS-miR-16-5p组较同期Blank组和miR-NC组细胞愈合率降低(P<0.05)，见图3。此外，Transwell实验结果显示，AS-miR-16-5p组较同期Blank组和miR-NC组细胞迁移能力降低(P<0.05)，表明AS-miR-16-5p对NSCLC A549细胞的迁移能力具有明显的抑制作用，见图4。

图3 AS-miR-16-5p对NSCLC A549细胞愈合率的影响

图4 AS-miR-16-5p对NSCLC A549细胞迁移能力的影响(×200)

2.4 AS-miR-16-5p对PTEN/PI3K/AKT通路蛋白表达的影响与miR-NC组和Blank组相比，AS-miR-16-5p组PTEN蛋白表达显著升高(P<0.05)；相反，PI3K和p-AKT蛋白表达显著下降(P<0.05)；表明AS-miR-16-5p调节PTEN/PI3K/AKT通路蛋白表达，见图5。

图5 AS-miR-16-5p对PTEN/PI3K/AKT通路蛋白表达的影响

3 讨论

NSCLC是一种常见的呼吸系统恶性肿瘤，其发病率和死亡率逐年增加，占肺癌的总发病率80%左右[10-11]。miRNA是由19-24个核苷酸组成的内源性非编码RNA，与靶标mRNA的5′-URT或3′-UTR互补位点结合以调节靶标基因的表达，并进一步抑制翻译和降解靶标基因。目前发现的miRNAs达1000余种，在癌症的疾病进程中呈现高表达或低表达，发挥癌基因或抑癌基因的作用。miR-16-5p是miRNA-16家族中的一个亚型，现已明确miR-16-5p是一种抑癌基因，在肿瘤的发生、发展过程中具有调节细胞增殖、迁移和侵袭的能力[12-14]。在这项研究中，发现转染细胞中AS-miR-16-5p表达降低。靶向PTEN/PI3K/AKT信号通路的AS-miR-16-5p通过调节细胞活性和迁移对NSCLC具有抗癌作用，这可能为NSCLC的精确治疗提供理论参考。

PTEN/PI3K/AKT通路参与细胞增殖、凋亡等多种生命活动[15-18]。PTEN为人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因，是NSCLC中已知的预后标志物和肿瘤抑制因子，同时具有脂质磷酸酶和蛋白磷酸酶活性[19]。PTEN的低表达或者失活能够增强PI3K/AKT信号通路活化。PI3Ks家族包含在PI3K/AKT信号通路中，通过调节抗肿瘤药物研究中的各种细胞过程，成为重要的肿瘤靶标[20-21]。有研究证实，在许多肿瘤中减少或不存在的抑癌基因PTEN具有双重特异性磷酸酶活性，其脂质磷酸酶活性通过灭活PI3K/AKT信号通路来阻止生物过程，从而抑制肿瘤的发展[22]。也有文献记载，PTEN的失活通过激活PI3K/AKT信号通路增强了NSCLC细胞的侵袭能力，PTEN表达的上调可以抑制NSCLC细胞增殖并促进细胞凋亡，说明在NSCLC细胞中PTEN通过负调节PI3K / Akt通路来发挥其抑癌作用，而PI3K/Akt通路在生长发育、增殖、凋亡、迁移、浸润过程中发挥重要作用[23-25]。miR-16-5p已经被证实参与肿瘤细胞的迁移、侵袭和血管生成[26-28]。随后也被证实通过靶向PTEN靶标来调节细胞周期蛋白和PI3K/AKT信号通路来促进恶性黑色素瘤进展。本研究通过转染AS-miR-16-5p 48 h后A549细胞内miR-16-5p表达下调，又分别通过MTT实验、划痕实验和Transwell实验，证实AS-miR-16-5p能明显抑制A549细胞的活性和迁移。并且发现，应用AS-miR-16-5p抑制miR-16-5p后，PTEN蛋白表达增高，证明miR-16-5p调控PTEN表达，进而影响其下游PI3K和AKT蛋白表达。