广东省茂名地区新生儿葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症基因突变型研究

李富，陈海玲，聂俊玮，唐玉芬，蓝金生

茂名市妇幼保健院遗传优生优育科，广东 茂名 525000

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD)缺乏症是一种伴X-连锁不完全显性遗传病，一般情况下患者并不表现出典型的临床症状，但在特定诱因下，如感染、食用蚕豆或服用具有氧化作用的相关药物(磺胺类、伯氨喹啉类等)时，患者可出现急性溶血性贫血、黄疸等症[1-2]。据统计，世界范围内G6PD缺乏症发病率达4.9%，并表现出明显的地域差异，在我国呈“南高北低”分布[3-4]。广东省是G6PD缺乏症高发地区[5]，茂名地区2008—2018年新筛中心筛查数据显示，G6PD阳性率达7.58%，但目前茂名地区新生儿G6PD基因突变特点尚未见诸报道。本研究采用聚合酶链反应(polymerasechainreaction，PCR)多色探针荧光溶解曲线法(multicolor melting curve analysis，MMCA)对广东省茂名市新生儿G6PD基因突变进行检测，以期了解本地区新生儿G6PD基因突变类型及特点，为本地区新生儿G6PD缺乏症诊断和防治提供依据，现报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2018年1月至2019年11月茂名市妇幼保健院新生儿疾病筛查中心筛查的G6PD可疑阳性新生儿785例，其中男性560例，女性225例；年龄8 h～22 d，平均(8.31±2.53)d；临床表现为病理性黄疸、ABO溶血、贫血等；在获取监护人充分知情同意后，同时进行G6PD酶活性检测(采用G6PD/6PGD荧光比值法)和基因突变检测(采用MMCA法)。

1.2 方法 (1)标本采集：新生儿入院后于足跟外侧或内侧处采血，滴加在S&S903采血滤纸上，共采集3个直径不小于8 mm的血斑，自然晾干后，行G6PD/6PGD荧光比值法检测G6PD酶活性；剩余血斑放入清洁塑料袋内密封，于4℃条件下保存，待进行新生儿G6PD基因突变检测。(2)G6PD酶活性检测：采集足跟静脉血，采用G6PD/6PGD荧光比值法检测G6PD酶活性，使用Auto TRFIA-2自动荧光免疫分析仪进行检测，试剂盒购自广州市丰华生物工程有限公司，严格按说明书进行检测。结果判定：G6PD/6PGD≥0.95为正常，0.7≤G6PD/6PGD＜0.95为轻度缺乏，0.5≤G6PD/6PGD＜0.7为中度缺乏，G6PD/6PGD＜0.5为重度缺乏。(3)MMCA法检测G6PD基因突变：采集的干血斑使用打孔器打下2个3 mm纸片，采用Lab-Aid 824型全自动核酸提取仪(厦门致善生物科技有限公司)提取DNA样本，DNA试剂盒为配套试剂盒，按说明书步骤严格执行。提取样本采用实时荧光PCR扩增仪扩增后，应用G6PD基因突变检测试剂盒(厦门致善生物科技有限公司)检测。参照试剂盒说明书对样本基因型进行判读，该试剂盒可用于检测中国人群常见的16种G6PD基因突变类型。

1.3 应用SPSS20.0软件进行数据统计分析。计数资料比较采取χ2检验，所有检验均采取双侧检验，检验水平α=0.05。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 G6PD酶活性检测结果 785例新生儿中检出酶活性缺乏者625例，占79.62%，男性和女性酶活性正常、中度缺乏和重度缺乏新生儿比例比较差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

表1 男性和女性G6PD酶活性检测结果比较[例(%)]

2.2 茂名地区新生儿G6PD基因突变情况 茂名地区785例新生儿样本中共检出706例G6PD基因突变样本，男性499例，女性207例，总突变率为89.94%(706/785)；共检出10种单一基因突变类型，占97.17%(686/706)；共检出14种复合基因突变，占2.83%(20/706)；其中占比排前三位的分别是c.1388 G＞A、c.1376G＞T和c.95A＞G，合计占78.90%(557/706)，见表2。

表2 706例新生儿G6PD基因突变情况(例)

2.3 G6PD基因突变新生儿的基因型和表型一致性分析 499例男性G6PD基因突变样本，均表现为G6PD酶活性缺乏，207例女性G6PD基因突变样本中，56.04%(116/207)的表现为G6PD酶活性缺乏，43.96%(91/207)的G6PD酶活性正常。

3 讨论

G6PD缺乏症主要起因于G6PD基因突变，进而导致酶活性缺乏，是新生儿高胆红素血症的主要致病原因，并以病理性黄疸、溶血性贫血等为主要临床症状。目前临床上G6PD缺乏症主要以预防症状发生和对症治疗为主。因此，对高发地区新生儿G6PD缺乏症进行筛查、明确诊断，进而通过积极预防、控制诱因以期尽可能减少疾病对患儿健康的损害。酶活性检测法由于操作便捷，是目前临床上多数医院诊断G6PD缺乏症的方法之一，但该方法受较多因素影响，对于女性杂合子的敏感性较低，存在一定漏诊率[6]。目前G6PD缺乏症诊断的金标准是直接明确突变的位点和性质，为临床提供准确的诊断依据，也可指导患儿避免接触易导致溶血的食物和药物，有效地避免了急性溶血性贫血及由此导致的高胆红素血症的发生。

近年来，G6PD基因突变检测中MMCA法应用日益增多，该方法对国人常见的16种G6PD基因突变类型检测具有较高的灵敏度、特异度，同时其批量检测能力、短时耗、结果易判读等特点提高了检测效率[7-8]。本研究采用MMCA法从785例疑似G6PD缺乏症新生儿中检出706例G6PD基因突变样本，其中499例男性突变患儿全为G6PD酶活性缺乏，男性患儿的基因型和表型100%吻合；而检出G6PD基因突变的207例女性患儿中，116例表现为G6PD活性缺乏，余91例则表现为正常G6PD活性，且均为杂合突变，提示G6PD基因型和表型一致性存在明显的性别差异，在男性患儿明显更高，与刘秀莲等[9]研究结果相符，这种差异由G6PD缺乏症的遗传特点决定，女性杂合子既可表现为G6PD活性缺乏，也可表现为G6PD活性正常[10]，由此可见单一的酶活性检测易导致此类患者漏诊，增加后代患病风险。另外，本研究中酶活性重度缺乏的患儿占比较高，主要由于c.1388 G＜A、c.1376G＞T、c.95A＞G和c.871G＞A等Ⅱ类变异占主导地位，合计占87.39%，根据世界卫生组织G6PD基因突变相关表型分类，通常Ⅱ类变异导致的G6PD残留酶活性不足10%[11]。

据相关报道，c.1388 G＞A、c.1376G＞T和c.95A＞G是国人G6PD基因突变的最常见类型[12-13]。本研究发现广东茂名地区也同样如此，在所有突变类型中，此三者按由高至低顺序居前三位，且合计占总突变人数的78.9%，与彭瑛等[14]报道的中国西南三区G6PD主要突变情况相一致，但茂名地区c.1388 G＞A、c.1376G＞T突变型占比相比更高；此外，与唐芳等[15]报道的广州地区G6PD主要突变情况较为一致，但茂名地区复合突变比例较高。从性别方面考虑，不论男性或是女性患儿，c.1388 G＞A和c.1376G＞T突变型均处于前两位，而第三位有所不同，男性为c.871G＞A，而女性患儿为c.95A＞G，相关研究指出性别可能是G6PD基因突变类型的影响因素[16]，当然本研究也可能由于检测样本有限，可考虑进行扩大样本进行研究论证。另外，本研究中有10例酶活性缺乏的患者并未检测出G6PD基因突变，这可能与这些样本的基因突变不在试剂盒检测参数范围内有关，因此在条件允许情况下可考虑通过基因测序来确定新的或少见的G6PD基因突变类型。

综上所述，c.1388 G＞A、c.1376G＞T和c.95A＞G是茂名地区G6PD缺乏症的热点突变，G6PD基因型和表型一致性存在明显的性别差异，在男性患儿明显更高；单独酶活性检测易导致女性杂合突变漏诊，结合该病为X连锁不完全显性遗传的特点，应在高发地区女性孕产妇中增加G6PD基因突变检测，以预防新生儿高胆红素的发生。