基于“熵增驱动凝胶形成”理论的魔芋葡甘聚糖——表没食子儿茶素没食子酸酯拓扑微凝胶的制备及其抗氧化性研究

王雅立， 庞 杰，颜吉强

（1.福建农林大学食品科学学院，福建 福州 350002；2.福建农林大学计算机与信息学院，福建 福州 350002）

茶多酚是一种植物多酚，是绿茶中有效的天然抗氧化剂，作为一种抗氧化剂和品质保持剂（防腐剂）[1]，其价值已经被世界所公认。表没食子儿茶素没食子酸酯（Epigallocatechin gallate，EGCG）是茶多酚中清除自由基、抗氧化能力最强的一种，但有研究表明，其在强酸、强碱、光照和高热条件下不稳定，而且在体内生物利用度也较低[1-2]，这些因素都限制了EGCG的推广应用[3]。目前，以多糖微凝胶为载体的高分子-功能因子的轭合物体系在改善EGCG亲水性、提高靶向性，以及增加生物利用度[3-5]方面都具有比较显著的优越性。但真正进入生产应用的此类轭合物还是比较少，这是因为多糖凝胶体系形成缺乏有效控制，因而影响其力学性质。由于凝胶形成过程总是伴随着系统熵的变化[6-7]。因此，通过一定条件下调控系统熵的变化，可以有效促进凝胶的形成，优化凝胶的力学性质。

魔芋葡甘聚糖（Konjac glucomman，KGM）是由葡萄糖和甘露糖以β-1,4糖苷键连接起来的高分子杂多糖，具有良好的生物兼容性和可降解性[8]。在一定条件下，KGM可形成拓扑结构，有利于提高活性物质的稳定性[9-10]。因此，尝试运用试验分析手段、计算机模拟和拓扑学分析相结合的方法，基于“熵增驱动凝胶形成”理论，以KGM为对象，促进KGM拓扑微凝胶的形成，制备功能化拓扑型KGM微凝胶并验证其抗氧化性。以期为基于拓扑网络的KGM功能凝胶的研究提供理论依据，也为绿茶的深加工和实用价值的提升提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

魔芋精粉（KGM纯度95%），广西多环公司提供；纤维素酶，无锡酶试剂厂提供；表没食子茶多酚没食子酸酯（EGCG），成都生物制药有限公司提供；DPPH，日本东京工业公司提供；KH2PO4、K2HPO4，国药控股化学试剂有限公司提供。

1.2 KGM-EGCG微凝胶的制备

1.2.1 低分子量KGM的制备

精密称取KGM（3 g），置于烧杯中，加入100 mL蒸馏水，使KGM在水中充分溶胀形成凝胶。以180 U/g的纤维素酶，在酶解后，在pH值6，温度50℃下，酶解30 min，用80%乙醇做沉淀剂，不停搅拌，逐渐有白色絮状沉淀产生，继续加入乙醇溶液直至不再产生沉淀为止，用玻璃棒小心将白色沉淀转移到烧杯中，用95%的乙醇洗涤2次，最后将此产品转移到表面皿中，真空冷冻干燥得样品。随后超微粉碎过200目筛获得KGM低聚物颗粒。

1.2.2 EGCG溶液的制备

称取一定量的EGCG（0.2 g），溶解在100 mL水溶液中，在50℃条件下，充分混合即得EGCG溶液。

1.2.3 KGM-EGCG微凝胶的制备

称取一定量的EGCG，溶解在100 mL一定浓度的低分子量KGM溶液中，在适宜温度条件下，两者混合后继续以转速600 r/min搅拌60 min，使KGM和EGCG两者充分溶胀，得到微凝胶。使用冷冻干燥机进行冻干，12 h之后取出。过200目筛，得到微凝胶。

综合考查试验条件，共设计了3个单因素试验，对EGCG/KGM微凝胶的制备进行考查，3个单因素分别为KGM质量分数（A）、EGCG/KGM质量比（B）和温度（C），以微凝胶的包埋率为指标，得出每种因素对微凝胶包埋率的影响。包埋率的公式（1）[11]为：

采用溶剂对微凝胶表面进行清洗，并测量微凝胶外未包裹的EGCG。EGCG含量测量参照国家标准GB/T 8313—2018[12]，通过HPLC法进行测定。

（1）KGM质量分数的选择。固定EGCG/KGM的质量比为1∶10，反应温度为50℃，制备一定体积的KGM溶液，按照KGM溶液的质量分数比1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%来称取KGM，并制备微凝胶，遴选最佳KGM质量分数。

（2）EGCG/KGM质量比的选择。固定KGM质量分数为2%，反应温度为50℃，按照EGCG与KGM质量分数比为1∶3，1∶5，1∶10，1∶15，1∶20来制备微凝胶，筛选出最佳的EGCG/KGM质量比。

（3）反应温度的选择。固体微凝胶的KGM质量分数为2%，EGCG/KGM质量比为1∶10，设定KGM溶液与壁材胶体混合时的反应温度为40，45，50，55，60℃，并制备微凝胶，筛选出最佳反应温度。

1.3 KGM-EGCG微凝胶的表征

1.3.1 扫描电子显微镜

在扫描电子显微镜下观察KGM粉末、KGMEGCG微凝胶的表面形貌，最大加速电压为15 kV。

1.3.2 红外光谱扫描

充分碾碎KGM和KGM-EGCG并采用KBr粉末压片，红外光谱测定波长为4 000~400 nm，仪器分辨率0.5 nm，扫描次数为32/64。

1.4 KGM-EGCG微凝胶抗氧化性能力的测定

1.4.1 O2-·清除率的测定

O2-·清除率的测定参照参考文献[13-15]的方法并作修改。将邻苯三酚溶于10 mmol/L HCl中配制浓度为3 mmol/L的溶液。取pH值8.2的Tris-HCl缓冲液（浓度100 mmol/L）4.5 mL于25℃水浴保温20 min，再加入邻苯三酚1 mL（试验前于25℃保温），迅速摇匀并开始计时，每隔30 s于波长325 nm处测定吸光度A325，反应4.5 min后结束。计算公式（2）为：

式中：v空——KGM-EGCG微凝胶抑制邻苯三酚自氧化的速率；

v样——空白管中以蒸馏水作对照抑制邻苯三酚自氧化的速率。

1.4.2 DPPH·清除率的测定

参照参考文献[16-18]的方法，用95%乙醇溶液配制浓度为0.2 mmol/L的DPPH溶液。取2 mL DPPH溶液于试管中，在暗室下避光反应30 min后于波长517 nm处测定吸光度（As）。以95%乙醇溶液作为对照（Ac），空白对照以95%乙醇溶液代替DPPH溶液（Ab）。DPPH清除率按公式（3）计算：

1.5 计算机模拟方法

应用AutoDock Vina软件对EGCG和PPO中的酪氨酸酶分子进行对接[4]。建立EGCG和酪氨酸酶分子坐标文件，确定EGCG和酪氨酸酶发生相互作用的格子参数条件。将准备好的EGCG和酪氨酸酶分子坐标文件和格子参数文件输入对接程序，运行后给出配体分子对接的构象，分析预测能量。对配体分子进行相似构象聚类分析和配体分子构象进行可视化分析。

1.6 理论方法

根据玻尔兹曼的理论，一个系统的自由能与所有可能的能量有关。对于一种给定状态的能量，其依赖于每个分子链与它周围物质之间的交互作用[18]。KGM拓扑微凝胶的形成是一个拓扑分子链重新平衡的过程，过程中伴随着能量变化和熵增。因此，依据热力学理论，可以通过减少溶剂熵，增加溶质熵来促进“熵增驱动下的凝胶形成”。

2 结果与分析

2.1 EGCG与酪氨酸酶相互作用的计算机模拟分析

多酚氧化酶（PPO）广泛存在于自然界中，在动植物组织中均可检测到。在广义上，多酚氧化酶可分为三类，广泛分布于植物和微生物中，微生物中包括酪氨酸酶和漆酶。研究表明，EGCG对于酪氨酸酶有抑制作用，且抑制率会随着浓度增大而提升[19]。为了分析EGCG与酪氨酸酶的相互作用，通过AutoDock Vina软件对EGCG与酪氨酸酶的相互作用的分子对接进行分析。

2.1.1 疏水作用下的EGCG与酪氨酸酶分子对接

疏水作用下的EGCG与酪氨酸酶分子对接见图1。

图1 疏水作用下的EGCG与酪氨酸酶分子对接

图1中的虚线为疏水键，根据模拟结果，酪氨酸酶分子结构复杂，在水中会以疏水轴为中心形成卷曲螺旋结构，进行蛋白质折叠，折叠过程中，酪氨酸酶倾向于将疏水基团埋藏在分子内部，将亲水基团暴露在外部的现象。此时，系统呈现熵值增加的情况，由于分子链运动活跃，疏水作用进一步增强，使酪氨酸分子产生自我聚集现象，形成分子内部空间。而反应中EGCG通过疏水键向酪氨酸酶分子表面靠近，并通过疏水作用进入到酪氨酸的疏水空间中与酪氨酸酶分子链产生相互作用，体系整体熵值增加，并且熵增成为疏水作用的驱动力，促进EGCG与酪氨酸酶进一步结合，这结果符合“手套2手”的反应模式[20]。

2.1.2 EGCG与酪氨酸酶的分子结合

EGCG/酪氨酸酶分子结合的氢键见图2。

图2 EGCG/酪氨酸酶分子结合的氢键

图2中的虚线为氢键，根据模拟结果，当EGCG进入酪氨酸酶的疏水内空间后，两者之间通过多点氢键结合，形成紧密接触，形成一定的空间网络结构，从而减小酪氨酸酶的水力学半径，使其产生一定的构象变化。氢键的形成有利于整体系统的稳定，降低系统能量。据此可得，随着EGCG浓度增大，其对疏水作用的贡献会增大，氢键连接数量会增多。两者的结合过程中，分子间作用力增强，存在明显的焓熵补偿现象。

2.1.3 EGCG与酪氨酸酶结合的稳定性

EGCG与酪氨酸酶两者结合会带来体系构象的变化。可以通过运动学描述来考查结合前后2个状态坐标的差异来评价分子结构变化的程度[4]。假定体系中所选粒子组有n个粒子，计算状态的体系坐标为vi，参考状态的体系坐标为wi，则粒子（组）的参考位置的偏差平均大小（RMSD）为：

EGCG/酪氨酸酶分子对接的能量见表1。

RMSD描述粒子（组）与参考位置的偏差平均大小，RMSD越小说明分子构象变化越小，体系越稳定[4]。由表1可知，通过多次模拟，在EGCG/酪氨酸酶最佳分子对接下，分子间作用力变化幅度较少，但系统的RMSD均较大。说明了熵增体系中，两者结合分子链的动态变化多，粒子位移大，构象变化大，两者对接体系不稳定。

表1 EGCG/酪氨酸酶分子对接的能量

2.1.4 最佳对接情况三级结构下的稳定性

最佳对接情况三级结构下的温度因子图见图3。

图3 最佳对接情况三级结构下的温度因子图

由图3可知，蓝色结构是柔性较小、比较稳定的部分，而红色部分则是柔性较大，在模拟过程中不太稳定的部分。以此作为评价EGCG-酪氨酸酶系统的稳定性或选取功能设计部分的依据，可知分子对接中EGCG分子链不稳定性较高。EGCG分子链的断裂会造成对接网络体系构象和力学半径的变化，因此保证EGCG构象的稳定性是调控对接体系稳定性的关键点。

2.2 溶质熵增下的KGM拓扑微凝胶的形成

根据玻尔兹曼的理论，一个系统的自由能与所有可能的能量有关。对于一种给定状态的能量，其依赖于每个分子链与它周围物质之间的交互作用[18]。应用熵的多粒子相关函数理论可以把溶液的熵及内能分成3个部分：①溶剂-溶剂相互作用“ss”；②溶质-溶剂相互作用“sp”；③溶质-溶质“pp”相互作用[18]。

整体能量可以表述为：

式中：z——给定格子空间内的配位数；

M——空间内的高分子链的数目；

φ——溶剂的体积分数。

当考虑高分子链为单个分子链时，可以得到相应的熵为：

当考虑高分子链而不是单个分子链时，高分子分子链数量为N时，可以得到相应的熵项为：

KGM凝胶的形成是其拓扑分子链结构重新平衡的过程，是个溶质-溶质相互作用起主导作用的能量变化的过程[21]，是一个包含熵增的过程；溶质-溶剂熵的存在有利于系统平衡；溶剂熵增大会提高凝胶的溶解度。结合以上数学公式，在环境条件不变的情况下，要促进KGM拓扑凝胶的形成，需要降低体系的溶剂熵并对分子链的长度进行调整。由公式（4）可知，在温度、压力等环境条件不变的情况下，KGM拓扑分子链只有获得足够的自由能和熵才能形成稳定的分子间缠结，从而达到新的拓扑结构稳态，因此需要减少溶剂熵[22]。KGM分子量大，分子链长，会减少构型，它们的熵减少为1/N。当高分子链非常长的时候，熵只包含溶剂的贡献。因此，需要通过适当调控KGM分子链的长度。在试验对KGM高分子进行水解，以提高溶质熵，并促进拓扑微凝胶的形成。

2.3 KGM-EGCG微凝胶制备

2.3.1 EGCG含量的筛选

参照国家标准GB/T 8313—2018[23]，制备供试品，按标准色谱条件检测，进样量为10.0μL，样品进样2次，测定EGCG含量。

EGCG色谱图见图4。

图4 EGCG色谱图

2.3.2 KGM质量分数的筛选

固定EGCG/KGM质量比及反应温度，用5种KGM质量分数制备出微凝胶的包埋率。

KGM质量分数对KGM-EGCG微凝胶包埋率的影响见图5。

图5 KGM质量分数对KGM-EGCG微凝胶包埋率的影响

由图5可知，微凝胶的包埋率随着KGM质量分数的增加而上升，但当低分子量KGM质量分数到达2%之后包埋率上升趋于平缓。可能的原因是在质量分数大于2%之后，分子链的空间位阻增多，阻碍了EGCG进入KGM拓扑网络，导致EGCG的包埋量并没有随着KGM的增加继续增加，与增加量不呈正比。在KGM质量分数大于3%之后，溶液浓度太大，已无法搅拌，故选择KGM质量分数为2%。

2.3.3 EGCG/KGM的质量比筛选

固定KGM浓度和反应温度，用5种不同EGCG/KGM质量比制备微凝胶的包埋率。

EGCG/KGM质量比对KGM-EGCG微凝胶包埋率的影响见图6。

图6 EGCG/KGM质量比对KGM-EGCG微凝胶包埋率的影响

由图6可知，微凝胶的包埋率先上升后下降，最高峰出现在EGCG/KGM质量比为1∶10处，所以质量比选择为1∶10。结果分析，KGM浓度增大，分子链间作用力增大，分子链缠结增多，增大了空间位阻，从而阻碍了EGCG分子进入KGM拓扑网络。

2.3.4 最适反应温度的筛选

固定KGM质量分数和EGCG/KGM质量比之后，在5个反应温度下制备微凝胶的包埋率。

温度对KGM-EGCG微凝胶包埋率的影响见图7。

由图7可知，微凝胶的包埋率随着温度的增加而增加，在50℃之后升高的速度减慢。因为随着温度升高体系能量增加，出现熵增情况，KGM拓扑分子链运动加剧，分子链之间形成有序的空间拓扑网络结构，可以较好地包埋并保护EGCG分子，但是温度过高会造成EGCG分子的不稳定和分解，从而降低了包埋率，所以选用50℃为反应温度。

图7 温度对KGM-EGCG微凝胶包埋率的影响

2.4 KGM-EGCG微凝胶的表征

2.4.1 扫描电子显微镜谱图分析

KGM粉末（a）和KGM-EGCG微凝胶（b）扫描电镜图见图8。

图8 KGM粉末（a）和KGM-EGCG微凝胶（b）扫描电镜图

由图8（a）可知，图KGM在粉末状态下，外表呈现规则的微纤维状，表明KGM分子量很大，长分子链以列向形态排列，长链之间以氢键相互作用，形成凝聚缠结为主的微观构。

由图8（b）可知，降解后KGM长分子链仍然存在，由于分子量降低，部分长分子链被降解为小分子链，空间位阻减小，有利于KGM-EGCG分子链之间形成非共价相互作用。KGM表面的羟基与水形成刚性结构，内部形成疏水空腔或间隙，接着通过疏水相互作用驱使EGCG进入空腔或间隙，并且形成分子链间氢键增强其结合效果，其结果导致微凝胶体系内部形成不同的微观结构形态。调节控制下的KGM-EGCG的混合使得体系混合过程匀化，避免了局部过度缠结，避免分子链混乱缠结的发生，使得网络体系形成有序的分子间拓扑缠结网络体系。

2.4.2 红外光谱谱图分析

KGM和KGM-EGCG微凝胶的红外光谱图见图9。

由图9可知，相较于KGM凝胶，KGM-EGCG微凝胶在波数3 435 cm-1处（-OH的吸收峰）的吸收峰减弱，表明KGM-EGCG微凝胶中有更多氢键的形成。同时，KGM-EGCG微凝胶在波数2 928 cm-1出现了一个明显的吸收峰，这是甲基中C-H的吸收峰，证明了KGM-EGCG微凝胶中，KGM与EGCG分子链之间形成拓扑缠结，与电镜测定结果相一致。

图9 KGM和KGM-EGCG微凝胶的红外光谱图

2.4.3 KGM-EGCG微凝胶抗氧化能力分析

（1）O2-·清除率分析。

不同浓度下EGCG与KGM-EGCG对于O2-·清除率对比测定见图10。

图10 不同浓度下EGCG与KGM-EGCG对于O2-·清除率对比测定

O2-·清除率是物质抗氧化能力指标之一，O2-·清除率越强表示物质的抗氧化能力越强。由图10可知，以KGM微凝胶为载体的EGCG对于O2-·清除率随着质量浓度增大而增大，与EGCG溶液表现出等同的清除能力。

（2）DPPH·清除率分析。

不同质量浓度下EGCG与KGM-EGCG对于DPPH·清除率对比测定见图11。

DPPH·清除率也是物质抗氧化活性能力的表征之一，DPPH·清除能力越大，表明物质的抗氧化活性越强。由图11可知，EGCG和KGM-EGCG两者都随质量浓度的增大而增强DPPH·清除率。当质量浓度为25 mg/mL时，KGM-EGCG微凝胶的DPPH清除率达到了93%。

图11 不同质量浓度下EGCG与KGM-EGCG对于DPPH·清除率对比测定

3 结论

微凝胶和相应的宏观凝胶具有相同的化学组成和热力学性质，但是微凝胶对环境引发的溶胀和分子结合的变化反应更加迅速，使其能够在受控和限制的条件下得到更好的应用[6，24]。而且微凝胶能够将化学官能团对于高分子整体结构的适应性、渗透性和变形性结合起来，以独特的方式将胶体聚合物和表面活性剂结合起来[25-26]。

在大多数情况下，凝胶网络中的连接是局部化的，是短距离相互作用的结果，但是在短距离的连接的基础上，长链会连接并形成宏观的网络。因此，大多数凝胶的分子网络结构形成是通过分子链在有限空间内的扩展连接局部连接来实现的。KGM作为高分子长链物质，在可逆凝胶形成以下2种途径：①通过自身连接组装形成长链来组装形成宏观的网络，如KGM单体凝胶；②通过与其他物质的分子链互相穿插交联形成网络结构，如KGM与卡拉胶、黄原胶、蛋白质等物质的复配，在协同作用下形成机械强度较好的凝胶。研究表明，复配凝胶的特点是分子间的疏水相互作用、氢键和静电相互作用力增强，复配胶体的胶束紧密缠绕链接。

通过分子模拟研究了EGCG和酪氨酸酶的分子结合，明确了两者结合是在熵焓补偿现象下，通过疏水作用进行分子链间的相互作用，并通过氢键增强结合效果，但是EGCG在与酪氨酸酶结合过程中表现出不稳定性，需要加以调控。以微凝胶为载体，实现EGCG的有效承载和释放是一个有效的调控途径。研究中根据熵增驱动拓扑KGM凝胶形成理论，通过酶降解KGM，降低分子量，降解部分长分子链为短链，减少网络体系的空间位阻，增加分子链内部缠结的空间，并形成有效的拓扑缠结，来调控KGM有序拓扑网络结构的形成，从而促进KGM-EGCG微凝胶的形成。

KGM-EGCG微凝胶制备过程中，没有使用改性剂和催化剂，没有引入毒性基团，不会对样品造成二次污染，通过合理调控，使之产生有序的拓扑网络结构，并保留了KGM的生物活性，从而产生较好的控释效果。试验结果为KGM功能凝胶用于对活性成分的保护的研究提供理论依据和有益补充，也为绿茶的深加工和实用价值的提升提供参考。