慢性乙型肝炎肝组织中Atg7、LC3水平对HBV复制水平的影响

杨 林 河南省濮阳市油田总医院医学检验科 457000

乙型肝炎是一种因嗜肝DNA病毒所引起的病变，经研究统计，每年约有100万人死于HBV感染所致的原发性肝癌和肝硬化，目前感染机制尚未明确，但抑制HBV病毒复制是解决感染慢性化的重要课题[1]。自噬可作为一种防御机制，防止外来物质入侵，可降解细胞内受损细胞器和多余蛋白质，维持细胞正常生命活动，常规情况下，细胞均存在一个自噬基础水平，一旦机体处于蛋白质蓄积、内质网应激、病毒感染、饥饿等状态，自噬便会利用自身成分获得能量，进行自我保护[2]。自噬基因Atg7、LC3是自噬过程中的泛素连接酶，不仅与造血干细胞维持、脂肪分化、线粒体自噬、轴突膜运输等有关，还在代谢应激中调节细胞周期和凋亡中具有一定作用性[3]。而本文进一步探索了慢性乙型肝炎肝组织中Atg7、LC3水平对HBV复制水平的影响，报道如下。

1 资料和方法

1.1 一般资料 选取2018年3月—2020年5月140例慢性乙型肝炎患者(观察组)、140例健康体检者(对照组)为试验对象。观察组男81例，女59例，年龄30～65岁，平均年龄(48.45±11.12)岁。对照组男82例，女58例，年龄31～66岁，平均年龄(48.29±11.36)岁。两组一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)。纳入标准：(1)各项资料齐全，且自愿加入本次实验；(2)观察组有乙型肝炎病史，且HBsAg阳性。排除标准：(1)合并肾脏疾病者；(2)存在代谢性肝病、酒精性肝病者；(3)存在自身免疫性肝病或药物性肝损伤者；(4)合并其他病毒感染者。

1.2 筛查方法 筛查方式：细胞培养：细胞系Huh7、LC3，条件5% CO2和37℃，完全培养基为10%胎牛血清的DMEM。Atg7、LC3表达与模型建立：取细胞铺6孔板，其中敲减组合Atg7、LC3过表达组分别采用对照质粒及pcDNA3.1-HIS-c-Atg7、LC3质粒，RNA应用3000转染细胞，48h后分别进行EBSS北杨集处理，分析HBV病毒载量。免疫荧光：对石蜡切片进行脱蜡、抗原修复，甲醛(4%)固定15min，3次PBS洗涤，在室温打孔10min，3次PBS洗涤，运用3%BSA和1%羊血清的封闭液室温封闭1h，一抗4℃过夜，洗涤后，二抗避光1h，含有DAPI封片。HBV病毒载量测定：收集上清液，混匀样本稀释剂5μl,室温状态下静置10min，加入病毒核酸定量测试盒40μl PCR混合液，离心30s，2 000r/min，用仪器(ABI VII7)完成PCR扩增，具体方法按照说明书进行。

1.3 观察指标 (1)对比两组自噬相关蛋白7(Atg7)、LC3、HBV-DNA水平；(2)经Pearson法分析慢性乙型肝炎发生与Atg7、LC3、HBV-DNA相关性以及HBV-DNA与Atg7、LC3相关性；(3)据AUC及标准误评判各类筛查方式(Atg7、LC3及联合)的预测价值。

2 结果

2.1 对比两组各项指标 观察组Atg7、LC3、HBV-DNA水平高于对照组(P<0.05)。如表1所示。

表1 两组各项指标对比

2.2 分析各项指标之间相关性 慢性乙型肝炎发生与Atg7、LC3、HBV-DNA呈负相关性(P<0.05)；HBV-DNA与Atg7、LC3呈正相关性(P<0.05)。如表2所示。

表2 各项指标之间相关性分析

2.3 预测价值分析 预测价值分析显示，Atg7筛查预测的AUC为0.814，LC3筛查预测的AUC为0.845，Atg7联合LC3筛查预测的AUC为0.914。依据AUC及标准误，采用Z检验AUC差异。如LC3与Atg7的AUC比较：Z=(0.845-0.814)/(0.035×0.035+0.041×0.041)0.5=0.575，P值=[1-NORMSDIST(0.575)]×2=0.564。联合与LC3的AUC比较：Z=(0.914-0.845)/(0.009×0.009+0.035×0.035)0.5=1.909，P值=[1-NORMSDIST(1.909)]×2=0.056。联合与Atg7的AUC比较：Z=(0.914-0.845)/(0.009×0.009+0.041×0.041)0.5=1.644，P值=[1-NORMSDIST(1.644)]×2=0.100。如表3所示。

表3 Atg7、LC3及联合筛查预测HBV复制水平高表达价值

3 讨论

自噬在病原体感染时，可影响炎性因子对外来病原微生物应答敏感性和下调干扰素对病毒感染，抑制促炎因子分泌和形成，但随着相关研究增多，学者发现甲型流感病毒、柯萨奇病毒、脊髓灰质炎病毒能够通过此过程进行复制[4]。HBV便是引起干细胞自噬主要原因，HBV可通过乙肝病毒小表面蛋白，促使自噬体形成，利用溶酶体途径自噬调节自身分泌，而自噬可参与HBV复制过程，此为一项恶性循环，为了更好控制HBV复制，还需探索自噬基因对HBV复制过程的预判和影响[5]。

Atg7属于一种关键酶，在自噬体形成期间参与了Atg8-PE和Atg12-Atg5-Atg16L1两个关键自噬复合体形成[6]。在2018年一项实验中，学者发现Atg复合体能够干扰HBV病毒形成，减少病毒产量。在本次结果中，观察组Atg7高于对照组，说明，乙型肝炎患者可因肝组织受损和肝功能减弱，导致自噬水平被激活，出现明显自噬Atg7基因改变，而HBV-DNA与Atg7呈正相关性，说明HBV高表达与Atg7存在一定相关。LC3属于自噬相关的蛋白，是一种能够反映自噬起始阶段的分子标志物，常分为两个亚型，即LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ型，当机体发生自噬时，LC3-Ⅰ可出现脂质化变化，并形成LC3-Ⅱ，而LC3-Ⅱ能够与自噬体膜上磷脂酰乙醇胺结合，定位在体膜上，含量与自噬体数量相等。本次结果中，观察组LC3高于对照组，说明乙型肝炎患者在出现自噬体降解减少时，可影响溶酶体和自噬体融合，导致自噬体数量明显增加[7]。经Pearson法分析，HBV高表达与Atg7呈负相关性，说明HBV高表达与多种自噬基因均存在相关性。经ROC曲线分析，LC3筛查预测的AUC为0.845，Atg7筛查预测的AUC为0.814，Atg7联合LC3筛查预测的AUC为0.914，说明联合Atg7、LC3筛查更能够反映HBV复制状态。

综上所述，机体在合并HBV感染后，可引起Atg7、LC3表达增加，早期筛查Atg7、LC3水平，可预测HBV复制高表达情况，尽早预判疾病发生、发展，便于临床诊疗。