无前导肽细菌素研究进展及在动物养殖中的应用

张晓峰 ， 徐艳超 ， 任兰兰 ， 王一博 ， 王海花 ， 潘春梅

(1.河南牧业经济学院食品与生物工程学院 ， 河南 郑州 450046 ； 2.河南牧业经济学院动物医药学院 ， 河南 郑州 450046)

抗生素的开发和应用是人类20世纪最重要的科学成就，其在动物养殖中的广泛应用，虽然其在促进动物生长、提高经济效益方面发挥了巨大的作用，但药物残留和耐药性严重威胁人类健康，因此，抗生素替代品的开发成为人们关注的热点。细菌素是细菌在代谢过程中由核糖体合成的、对产生菌具有自身免疫性的一类具有抗菌活性的多肽类物质，具有体内外抑菌活性高，对人体无毒，可选择性强，不易产生交叉抗性，易于生物改造等特点，是良好的抗生素替代品[1]。然而，细菌素产量较低，规模化生产较难，成本较高等因素制约了细菌素的大范围应用。与大多数细菌素不同，无前导肽细菌素是一类由核糖体合成、翻译后不进行任何修饰即具有活性的细菌素[2]，该类细菌素遗传结构简单，易在其他微生物细胞中表达，便于通过生物工程进行规模化生产，抗菌机制独特，有巨大的商业应用潜能。本文对无前导肽细菌素的类型、理化特性、来源、结构特征、生物合成、抗菌机制及在动物养殖中的应用及发展前景进行了综述。

1 无前导肽细菌素类型、理化特征、来源及结构特征

Cotter等[3]根据细菌素结构特征将其分为两大类：翻译后修饰细菌素(I类细菌素)和翻译后非修饰细菌素(II类细菌素)，其中I类细菌素又分为12小类，II类细菌素又分为5小类，细菌素类型及结构特征见表1。

表1 细菌素类型及结构特征

按上述分类系统，无前导肽细菌素属翻译后非修饰IId类细菌素。自1998年第1个无前导肽细菌素Enterocin L50报道以来，至今已鉴定出11种不同种属33个无前导肽细菌素。该类细菌素通常含27～53个氨基酸残基，分子量相对较小，富含赖氨酸而缺少半光氨酸残基，带2～8个不等正电荷，有较高等电点，通常在N端甲酰化形成甲酰甲硫氨酸[4-8]。按其氨基酸序列的保守性可分为四类，见表2。

表2 无前导肽细菌素类型及结构特征

2 无前导肽细菌素的生物合成

通常，细菌素的生物合成分为3个过程，首先合成无活性的、N端含有前导肽序列的前体肽，然后前体肽在修饰酶的作用下进行翻译后修饰，最后除去前体肽中的前导肽序列从而变为有活性的成熟肽(图1)。前导肽是细菌素生物合成酶的识别位点，是酶-底物相互作用所必需的，并对细菌素产生菌有保护作用。大部分细菌素前导肽的切割和分泌需要其专门的前导肽序列，前导肽在细菌素的生物合成中起重要作用[9]。长时间以来，人们认为前导肽是细菌素生物合成所必需的，然而，无前导肽细菌素的生物合成过程却不形成前导肽序列，在翻译后不经任何修饰即转变有活性的成熟肽。

图1 细菌素生物合成示意图[8]修饰的残基

无前导肽细菌素简单的遗传结构使其很容易与其他微生物蛋白的N端扩展融合，因此也更容易被其他细菌、真菌或真核细胞表达。如来源于乳酸乳球菌的Lactcin Q和来源金黄色葡萄球菌的Aureocin A53能够在大肠杆菌(E.coli) BL21中大量表达，来源E.faeciumL50的双肽细菌素Enterocin L50A和Enterocin L50B已经在酿酒酵母和毕赤酵母中成功表达[10],除此之外，细菌素Lactcin Q也已在枯草芽胞肝菌中成功表达[11]。枯草芽胞杆菌在动物肠道中能够发挥重要的促进作用，其作为益生菌广泛应用于动物养殖业，酵母菌也是常用于动物养殖的肠道益生菌。细菌素在肠道益生菌中的成功表达能够增强益生菌的竞争优势，促进其在肠道中的定植。另外，无前导肽细菌素简单的遗传结构也便于进行分子改造，生产出新型的、更具优势功能的细菌素，同时进行规模化生产。如在菌株Lc.garvieae基因组中增加无前导肽细菌素Garvicin KS基因簇的拷贝数、优化培养基成分、优化培养条件可使该细菌素产量增加2 000倍[12]。

3 无前导肽细菌素的抗菌机制

通常细菌素通过与靶标细胞膜上特定受体结合形成“孔道”结构破坏细胞膜或抑制细胞壁形成发挥作用，如羊毛硫细菌素Nisin和细菌素Pediocin PA-1[13-14]。无前导肽细菌素通常带正电荷，能与带负电荷的靶标细胞膜相互作用形成“孔道”结构，使靶标细胞核酸、细胞质及相关离子等重要内容物泄露，膜电位消失、大分子合成终止而杀死细菌(图2)。同时，疏水作用在与靶标细胞膜的相互作用过程中也发挥了重要作用，因此，大多数无前导肽细菌素如Enterocin 7A、Enterocin 7B、Aureocin A53及Lactcin Q发挥抑菌作用不需要任何受体参与，抑菌谱较广[15-16]。如Lactcin Q首先通过静电吸引与靶标细胞膜结合，然后通过渗透在靶标细胞膜上形成“环形孔”使细胞内容物泄露从而杀死细菌[17]。Enterocin 7A、Enterocin 7B同样通过静电吸引和疏水作用与靶标细胞膜结合，随后α-螺旋解旋，疏水核暴露并插入膜靶标细胞膜中[18]。

图2 无前导肽细菌素抗菌机制示意图

4 无前导肽细菌素在动物养殖中的应用

细菌素是细菌在代谢过程中由核糖体合成的、对产生菌具有自身免疫性的一类具有抗菌活性的多肽类物质[19]。细菌素在生物合成、作用模式、抗性机制及抗菌活性方面与抗生素存在明显不同。细菌素是由微生物细胞核糖体合成机制产生的一种抗菌肽，而抗生素是由细胞产生的次级代谢产物；与抗生素生产菌不同，细菌素产生菌能够耐受其所产细菌素的影响；多数细菌素不需要任何受体，可以与靶标细胞上任何部位作用，通过与靶标细胞膜的相互作用产生空隙，使细胞内容物泄露而导致细胞死亡，而抗生素通常通过抑制细胞壁的合成，阻断细胞内蛋白质的表达，破坏DNA和RNA的复制来杀死靶标细胞；抗生素耐药性的增加取决于遗传因素的变化，能够从一代传递到下一代，而细菌素靶标细胞对细菌素的抗性主要与靶标细胞膜的化学组成相关，传递到下一代的可能性较小。细菌素无毒，易被蛋白酶降解而不残留，对很多抗生素抗性菌株有作用，可原位生产使其产生菌更具竞争优势，许多肠道细菌需要细菌素的产生才能定植[20]，肠道益生菌通过细菌素的产生更易定植于宿主而发挥作用。无前导肽细菌素遗传结构简单，易于在益生菌中表达，便于规模化生产，该类细菌素抑菌谱范围较窄但种类多样，能够在其发挥抑菌作用的同时较少影响宿主共生微生物，维持肠道菌群平衡，同时，多数无前导肽细菌素是由分离自食品或动物肠道的乳酸菌所产生，这些产生菌本身就是益生菌，具有天然的安全性。如无前导肽细菌素Garvicin KS、LsbB是从商品牛奶中分离到的乳酸菌所产生，Enterocin Q是从碎牛肉中分离到的粪肠球菌所产生，这些特性使无前导肽细菌素在动物养殖中的应用更具优势。

细菌素既可以通过添加到饲料或直接饲喂动物而发挥作用，也可以通过添加产细菌素的益生菌来发挥作用。从内蒙古牛、羊肠道中筛选的乳酸菌N8603可产生对强毒沙门杆菌、强毒鸡白痢杆菌、强毒大肠杆菌、腐生葡萄球菌等肠道致病菌有抗菌活性的细菌素，该细菌素有望开发为动物饲料添加剂[21]。来源于枯草芽胞杆菌的细菌素对鱼的4种致病菌有很好的活性，能够有效降低印度鲤科鱼类细菌致病性[22]。细菌素Subtilosin A来源于同时能够产蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶及脂肪酶的1株枯草芽胞杆菌，该细菌素可有效减少肉鸡肠道致病菌的感染[23]。细菌素Lacticin 3147的摄入能有效降低动物链球菌的感染，能够用于奶牛乳腺炎的治疗，饲喂分离纯化自商业肉鸡盲肠中唾液乳杆菌所产的细菌素可以明显减低雏鸡肠道中的空肠弯曲杆菌[24-25]。同时，将产细菌素益生菌应用于动物养殖中不仅可以抑制肠道致病菌的增殖，而且能够增强益生菌的定植能力，促进益生菌的作用效果。研究证实，枯草芽胞杆菌能够在动物肠道中完成由芽胞营养体到芽胞的过程，能产生细菌素的枯草芽胞杆菌可以使其在与其他肠道菌群竞争中获得优势而定植[26]。另外，由于部分细菌素抑菌谱较窄而不易破坏宿主原菌群结构，如细菌素Thuricin CD与万古霉素、甲硝唑的抗菌活性相当，但Thuricin CD并不改变宿主共生菌结构，而万古霉素、甲硝唑的使用却使宿主变形杆菌门的细菌明显增加而其他细菌减少[27]。

研究表明，不同类型无前导肽细菌素对部分病原菌有协同作用，如Garvicin KS与Polymyxin B联合使用对不动杆菌和大肠杆菌有协同抑菌活性，Garvicin KS与Polymyxin B、Nisin联合使用能够快速杀灭并完全根除不动杆菌和大肠杆菌，Garvicin KS与Nisin联合使用对金黄色葡萄球菌有协同作用，Garvicin KS与Nisin、金合欢醇联合使用在低浓度下能快速根除黄色葡萄球菌[28]。

5 存在问题及展望

细菌素作为抗生素的替代品已广泛应用于动物养殖行业，然而多数仅对其抑菌活性及在动物养殖中的促生长作用进行了研究，而对其氨基酸序列、空间结构及作用机制并没有深入开展。对于无前导肽细菌素而言，目前分离和鉴定的数量很少，源于益生菌的无前导肽细菌素更少，源于动物肠道益生菌的无前导肽细菌素几乎没有，且仅有Aureocin A53、Lactcin Q、LsbB及Enterocin 7四种无前导肽细菌素的三维结构获得解析，其生产、调节及作用方式的分子机制尚未完全了解，这将会限制无前导肽细菌素在动物养殖中的应用。随着生物技术的发展，大量微生物基因组的公布和细菌素在线比对工具的应用，越来越多的无前导肽细菌素将会被发现和鉴定，更多的无前导肽细菌素空间结构及作用机制也将会揭示[29]。因来源于动物肠道的益生菌具有原位定植和促进动物肠道健康的优势，源自动物肠道益生菌的无前导肽细菌素能够发挥更好的原位抑菌效果，因此将源于不同种类动物肠道益生菌的无前导肽细菌素应用于原宿主是细菌素在动物养殖应用中的发展方向，加之该类细菌素遗传结构简单、易于进行分子改造，易于在其他微生物或益生菌中表达，易于利用生物工程进行规模化生产，这些特性使其在未来的动物养殖业中有更广泛的应用前景。