均质和酶解对燕窝口服液稳定性和消化特性的影响

范群艳

(1.福建农林大学食品科学学院，福建 福州 350002；2.厦门市燕之屋丝浓食品有限公司,福建 厦门 361100)

燕窝主要产于东南亚国家，具有数量稀少、味道鲜美和营养价值高的特点，早在唐代，它就被视为高级保健食品[1-2].燕窝的成分主要有蛋白质(62%～63%)和碳水化合物(25.62%～27.26%)，碳水化合物包括唾液酸、甘露糖、葡萄糖胺、半乳糖胺、半乳糖和岩藻糖等[3-4]，其中，唾液酸是目前燕窝中研究相对充分的成分，是一种含9个碳原子的单糖酰化衍生物，含量约为10%，通常以寡糖、糖脂或糖蛋白的形式存在[5-6].燕窝中的唾液酸位于糖蛋白链末端，通过抑制细胞表面一些重要的抗原位点和识别标记物，从而保护这些糖蛋白不被周围免疫系统识别和降解，具有抗流感病毒、抑制血凝[7-8]、保护胎儿免受母体先天免疫系统攻击[9]的作用，以及提高记忆力[10]等功效.燕窝中的蛋白质吸水后易膨胀，不仅影响其消化，且用常规加工工艺生产的燕窝口服液还存在粒度不均一和产品稳定性差等问题，因此需要寻找一种有效的加工方法，以提升燕窝口服液的储存稳定性及营养价值.

均质技术是一种有效降低流体食品的粒度以及增加流体食品的稳定性的物理加工技术，被广泛应用于乳制品和果汁的生产加工中[11-12].蛋白酶水解法通过破坏蛋白质分子中的肽链，降低蛋白质粒度[13]，将蛋白质特殊的功能基团暴露出来，使蛋白质的功能得到改善.

本研究以常规工艺制备的燕窝口服液为对照，比较均质、酶解和均质结合酶解对燕窝口服液稳定性和消化特性的影响，并通过体外模拟胃肠消化体系，研究蛋白质的水解度和游离唾液酸的生成情况，旨在为提高燕窝口服液的食用口感及营养价值提供参考.

1 材料与方法

1.1 材料

燕窝口服液由厦门丝浓食品有限公司提供.氯化钠、盐酸、磷酸二氢钠、氢氧化钠、甲醛、乙酸钠均为分析纯，为国药集团化学试剂有限公司产品.胃蛋白酶(250 U·mg-1)、中性蛋白酶(200 U·mg-1)、胰蛋白酶(250 U·mg-1)、透析袋(分子截留量为500～1 000 u)为北京索莱宝科技有限公司产品.

仪器与设备有GYB 30-6S均质机(上海东华高压均质机厂)、JM-L65胶体磨(温州强忠机械科技有限公司)、马尔文激光粒度仪(英国马尔文仪器有限公司)、Kjeltec 8400全自动凯氏定氮仪(FOSS公司)、NanoPlus纳米粒度与Zeta电位分析仪[麦克默瑞提克(上海)仪器有限公司]、Lumifuge全自动稳定性分析仪(德国LUM仪器公司)、LC-20A高效液相色谱仪(日本岛津公司)、ICS5000离子色谱仪(赛默飞世尔科技公司).

1.2 样品制备

燕窝口服液样品A、B、C、D的制备步骤如下.

其中，燕窝添加量为3%，灌装后杀菌条件为120 ℃、20 min.

1.3 指标的测定

1.3.1 溶解度测定 试样在9 600g离心15 min后，取上清液采用凯氏定氮法[14]测定蛋白质含量，另取未离心试样以相同方法测定总蛋白质含量.溶解度/%=(上清液的蛋白含量/样品的总蛋白质含量)×100.

1.3.2 粒径测定 采用马尔文激光粒度仪测定.仪器参数：背景测试时间15 s、遮光度5%～18%、搅拌转速3 000 r·min-1[15].每个样品重复测试5次.

1.3.3 稳定性测定 采用全自动稳定性分析仪测定.仪器参数：温度25 ℃、时间间隔15 s、转速3 000 r·min-1、轮廓线300条、总测试时间75 min[16].

1.3.4 Zeta电位测定 采用NanoPlus纳米粒度与Zeta电位分析仪测定.仪器参数：温度25 ℃、折射率1.33[17].每个样品重复测试3次.

1.3.5 体外模拟胃液消化试验 模拟胃液的配制：取32 mg胃蛋白酶加入10 mL 35 mmol·L-1NaCl，再用5 mol·L-1HCl调节溶液的pH为1.5[18].

分别取5 mL人工胃液和燕窝口服液样品，置于37 ℃预热10 min，预热后将两者混匀，置于水浴摇床(100 r·min-1)中于37 ℃反应240 min，用5 mol·L-1NaOH调节反应液的pH为7.0，停止反应[19].

1.3.6 体外模拟肠液消化试验 模拟肠液的配制：取10 mg胰蛋白酶加入1 mL 5 mmol·L-1NaH2PO4，用5 mol·L-1NaOH调节溶液的pH为7.4[20].

将等量的胃消化产物和人工肠液混匀，于水浴摇床(100 r·min-1)中于37 ℃反应240 min，反应结束后煮沸终止反应.

1.3.7 水解度测定 取1.5 mL体外模拟胃肠消化产物加入50 mL去离子水，调节溶液的pH为7.0，加入10 mL 38%甲醛，摇匀后在室温下静置5 min，再以0.1 mol·L-1NaOH将试液滴定至pH=8.5，根据消耗的NaOH体积计算水解度[21].

水解度/%=(NaOH消耗量×0.1 mol·L-1×14.007×1 000)/(样品量×样品中的总蛋白含量)×100.

1.3.8 唾液酸含量测定 结合唾液酸含量参照GB/T 30636—2014[22]的方法测定.称取10 g试样于透析袋中，在流水下透析24 h，再将透析袋浸泡于10%聚乙二醇中脱水至试液体积小于5 mL.将试液全部转入25 mL比色管中，加入等体积的冰乙酸，于沸水中水浴10 min进行酸解，冷却至室温后转入100 mL容量瓶中，并用流动相定容，混匀后取上清液用0.22 μm针式过滤器过滤，装瓶备测.

游离唾液酸含量测定：取适量试样，直接用流动相稀释、定容，用0.22 μm针式过滤器过滤，装瓶备测.

测试条件：300SCX阳离子交换色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：乙腈与0.1%磷酸的体积比=9∶1；柱温：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1；进样量：10 μL；紫外检测器波长：205 nm.

1.4 数据处理

采用GraphPad 8.0软件对数据进行单因素方差分析，用Tukey检验进行多重比较，表中数据为平均值±标准误差.

2 结果与分析

2.1 不同处理方式对燕窝口服液蛋白质溶解度的影响

由图1可知，燕窝口服液样品B、C、D的溶解度显著高于样品A(P<0.05).样品B是经均质处理后的样品，高压均质一方面通过物理性的剪切和冲击等作用将燕窝颗粒进一步打碎成粒径更细的微粒，另一方面还破坏了蛋白质分子间的静电相互作用、疏水相互作用、二硫键和氢键[23]，使蛋白质分子展开，极性基团的暴露增加，进而使蛋白质分子与溶剂(水)的相互作用增强，提高了蛋白质溶解度.样品C是中性蛋白酶酶解处理后的样品，其溶解度增加可能是因为中性蛋白酶与燕窝蛋白质接触后，蛋白质分子的肽链发生部分断裂，将蛋白质分子的疏水基团和极性基团暴露出来，增强了蛋白质的亲水性，使得燕窝蛋白质的溶解度提高[13].样品D的溶解度与样品B、C的差异不显著，表明酶解已经将蛋白质的溶解度提高到最大(94.85%)，再进行均质处理只是破坏蛋白质分子的大小，不影响其溶解度.

图柱上附不同字母者表示差异显著(P<0.05)，附相同字母者表示差异不显著(P>0.05).

2.2 不同处理方式对燕窝口服液粒径的影响

分别比较了4种生产工艺制作的燕窝口服液的粒径，测定结果如图2所示.

由图2可知:样品A的粒径最大，为20～1 000 μm，甚至有部分粒径大于1 000 μm;样品B的粒径为2～150 μm，样品C的粒径为5～810 μm，表明在降低口服液中燕窝颗粒粒径的效果上，均质处理强于酶解处理;样品D的粒径与样品B的差异不显著，但在10 μm处出现了一个小峰，这可能是因为燕窝中的蛋白质分子在酶的作用下先被破坏，在均质处理下部分蛋白质分子再进一步被破坏，形成部分粒径小的颗粒分子.

由各试样的直径分布(表1)可知，样品D的径距显著低于样品A、C(P<0.05).径距是指样品颗粒的分布宽度，表明均质结合酶解处理的粒径比单一酶解或单一均质处理更均匀，颗粒大小较均一.样品A、B的一致性显著高于样品D(P<0.05)，一致性是指粒径分布偏离中间的程度，表明均质结合酶解处理的粒径分布较均匀.样品A、C的比表面积显著低于样品B、D(P<0.05)，比表面积与粒径呈负相关，表明样品A、C的粒径显著高于样品B、D.D[3,2]和D[4,3]分别表示样品的面积平均径和体积平均径，Dx(10)、Dx(50)和Dx(90)分别表示小于此粒径的颗粒占全部颗粒的10%、50%和90%.样品A的D[3,2]、D[4,3]、Dx(10)、Dx(50)和Dx(90)最大，样品B、D的D[3,2]、D[4,3]、Dx(10)、Dx(50)和Dx(90)最小，表明均质处理对颗粒的降解效果优于酶解处理，此结果与图2的结论相一致

表1 燕窝口服液样品的直径分布1)

2.3 不同处理方式对燕窝口服液稳定性的影响

为了研究不同生产工艺对燕窝口服液稳定性的影响，采用全自动稳定性分析仪对其进行分析，结果如图3所示.样品共分为3层，分别为半月弯的半径、澄清层和不稳定的沉淀层.由图3可知，样品A的澄清层高度低于样品B、C、D.从样品离心后的效果图(图4a)可知，样品A的底部存在明显沉淀，表明样品A的稳定性较差，样品B、C、D有较好的稳定性，这与均质、酶解或均质结合酶解处理后，燕窝口服液中的颗粒粒径变小、溶解性和溶液体系均一的提升有关[24].样品A的半月弯高度显著低于样品B、C、D(图4b)，这可能是因为样品A的颗粒较大，经75 min离心后，颗粒之间的间隙减小，液面高度下降.透射值和澄清指数均与溶液的澄清程度呈正相关，反映了溶液的澄清度，样品的澄清程度与样品的稳定性呈正相关[25].从图4c和4d可知，样品A的透射值和澄清指数显著低于样品B、C、D(P<0.05).综上结果表明，样品B、C、D具有较高的稳定性，这可能是因为样品B、C、D的粒径较小，即溶质粒径越小，透射值和澄清指数越大，溶液体系的稳定性越好.有研究表明粒径与溶液的稳定性呈负相关[26-27]，可以反证这一结论.

图3 燕窝口服液样品的扫描图谱

a：经稳定性分析仪测定后的样品图(A、B、C、D分别表示样品A、B、C、D)；b、c、d分别表示样品的半月弯高度、透射值、澄清指数.*表示差异显著(P<0.05).

2.4 不同处理方式对燕窝口服液Zeta电位的影响

本研究比较了4种工艺产品的Zeta电位，结果(表2)显示，燕窝口服液样品A的电导率显著低于样品B、C、D(P<0.05)，表明经过均质、酶解或均质结合酶解处理的样品B、C、D溶液的离子强度变大，Falade et al[28]的研究结果也证实了这一结论.与之相互印证的是，溶液离子强度变大后，电导率上升，电场强度下降，电泳迁移率随之降低[29]，导致样品A的电泳迁移率显著高于样品B、C、D(P<0.05).样品A的Zeta电位最大，且从图2可知，样品A的粒径也是最大的(20～1 000 μm)，表明溶液的Zeta电位与粒径呈正相关，这与Ofir et al[30]、金凤[31]的研究结论相同.

表2 燕窝口服液样品的Zeta电位1)

2.5 不同处理方式制备的燕窝口服液在模拟体外消化条件下的验证

2.5.1 蛋白质的水解度 蛋白质的水解度反应蛋白质被酶水解的程度，通常用游离氨基生成量与总蛋白质含量的比值来表示[13].图5显示，经体外模拟胃液消化后，样品B、C、D的水解度显著高于样品A(P<0.05)，样品C的水解度显著高于样品B(P<0.05)，这是因为均质和酶解处理对样品中蛋白质分子影响的机理不一样，均质处理破坏的是蛋白质分子间的非共价键作用力，而酶解处理是对蛋白质肽链的截断.在胃液的作用下，样品溶液中的蛋白质分子经胃蛋白酶的消化，生成更多的游离氨基酸和可溶性小肽[28,32].经体外模拟胃液消化后，样品D的水解度显著高于样品C(P<0.05)，这可能是因为样品D中蛋白的肽键和分子间的非共价键作用力被破坏，胃液中酶的接触位点变多，更容易被酶水解.经体外模拟肠液消化后，样品D的水解度最大，样品A的水解度最小，表明均质和酶解处理后燕窝蛋白的消化率提高，特别是经均质结合酶解处理，可以提高燕窝口服液的营养价值.

图柱上附不同字母者表示差异显著(P<0.05)，附相同字母者表示差异不显著(P>0.05).

2.5.2 游离唾液酸含量 唾液酸作为燕窝的标志性成分，主要通过3、4天线的糖链与蛋白质相连形成糖蛋白[33]，经过胃肠消化后生成游离、低聚糖结合，亦或是低聚糖肽结合的唾液酸的混合物.尽管目前对于燕窝中的唾液酸在人体内主要是以那种形态被人体吸收利用尚不明确，但测定消化液中的游离唾液酸含量对于评价燕窝产品的消化性能仍具有一定的参考意义.通过比较4种生产工艺制作的燕窝口服液的唾液酸含量，结果(表3)显示，样品A、B、C、D的总唾液酸含量没有显著差异，而各试样的游离唾液酸含量与处理方式有关.各试样中游离唾液酸含量的大小表现为：样品A<样品B<样品D<样品C，且均存在显著差异(P<0.05).在本试验的相关研究中已经发现，于120 ℃杀菌20 min会导致少量结合唾液酸被水解生成游离唾液酸，样品C的游离唾液酸含量高于样品B(P<0.05)，表明中性蛋白酶酶解相较于均质更容易使结合唾液酸转化成游离唾液酸.

表3 消化前后燕窝口服液样品的唾液酸含量1)

经体外模拟胃液消化后，各试样中游离唾液酸含量的大小表现为：样品A<样品B<样品C≈样品D(P<0.05)，表明经酶解处理后，样品在模拟胃液中更容易被消化.经体外模拟胃肠液消化后，各试样中游离唾液酸含量的大小表现为：样品A≈样品B≈样品D<样品C(P<0.05)，表明均值处理对于结合唾液酸在模拟肠液消化中无改善作用，这可能是因为均质处理使蛋白质中更多的疏水基团暴露出来，导致蛋白质团聚[23,34]，使唾液酸被蛋白质分子包裹，限制了唾液酸的释放.需要指出的是，经过体外模拟胃肠液消化后，酶解处理只有1/4～1/3的唾液酸被释放出来生成游离唾液酸，但这并不意味着只有1/4～1/3的唾液酸可以被人体吸收利用，关于这一点还需要进一步的证实.

2.6 燕窝口服液理化性质与消化特性的相关性

采用Pearson相关性研究燕窝口服液理化性质与消化特性的关系，结果(图6)显示：样品蛋白质的溶解度与颗粒比表面积、透射值、电导率、游离唾液酸含量、蛋白质水解度呈正相关；样品的透射值、澄清指数与颗粒的径距、一致性、D[3,2]、D[4,3]、Dx(10)、Dx(50)、Dx(90)呈负相关，表明粒径与稳定性呈负相关；样品的Zeta电位与颗粒的D[3,2]、D[4,3]、Dx(10)、Dx(50)、Dx(90)呈正相关，表明粒径与Zeta电位呈正相关，这与Ofir et al[30]的研究结果一致.经体外模拟胃肠液消化后，样品的水解度与游离唾液酸含量呈正相关.综上可知，采用均质、酶解或均质结合酶解处理后，样品的稳定性和消化率均有所提高，在一定程度上能够提高燕窝口服液的存储稳定性和营养价值.

红色表示正相关，紫色表示负相关.

3 结论

燕窝作为一种具有高营养价值的珍惜食材，尽管自古以来就价值不菲，但随着国民生活水平的提高以及文化自信的恢复，近年在国内的消费规模飞速增长.而食用燕窝的产量受金丝燕种群数量以及生态环境的限制不可能无限提高，因此通过探索新的食品加工技术来提升燕窝营养的利用效率具有重要意义.本研究结果表明，均质、酶解和均质结合酶解处理均能降低燕窝口服液的粒径，提高蛋白质的亲水性和溶解度，从而提升口服液的稳定性和消化率.本研究结果对于当前燕窝口服液的生产工艺设计与改进具有启发与指导作用.