角鲨烯对早期断奶仔猪空肠形态、黏膜通透性和抗氧化能力的影响

高 阳, 杜 鑫, 李冰绡, 高亚锐, 张慧男, 张瀚林, 禹世欣, 柏 卉

(白城师范学院生命科学学院，吉林 白城 137000)

角鲨烯是一种天然的多不饱和三萜，广泛存在于动物肝脏和植物籽实中.1916年，日本学者在鲨鱼肝脏中提取出角鲨烯[1].最初，角鲨烯多用于缓解干燥和湿疹引起的皮肤损伤，因其具有高效的单态氧清除能力[2].随后，大量研究表明，角鲨烯在调节机体抗氧化、抗炎、免疫调节、心血管保护等方面也发挥着重要作用[3]；体内试验证明了角鲨烯的安全性和饲用可行性[4].Dhandapani et al[5]研究表明，角鲨烯在缓解异丙肾上腺素诱导的大鼠心脏氧化应激中发挥着重要作用.Zhang et al[6]研究表明，角鲨烯对种公猪精液品质具有较好的改善作用.Gabás-Rivera et al[7]研究表明，补饲角鲨烯可增加小鼠血清中高密度脂蛋白和对氧磷酶-1的水平，并缓解小鼠的氧化应激损伤.Chen et al[8]研究指出，角鲨烯能够改善Ross鸡胸肌肉品质.

然而，角鲨烯作为畜禽饲料添加剂的研究依旧不多，尤其是对早期断奶仔猪肠道健康方面的研究.众所周知，早期断奶加剧仔猪应激，从母乳到饲料的改变使尚未发育健全的仔猪肠道面临巨大挑战.因此，有效缓解仔猪早期断奶应激，维持仔猪肠道机能与健康，为猪场创造效益具有十分重要的现实意义.因此，本研究利用角鲨烯作为饲料添加剂，探究其对早期断奶仔猪空肠形态、黏膜通透性和抗氧化能力的影响，旨在为角鲨烯在猪生产中的应用提供实践依据.

1 材料与方法

1.1 材料

角鲨烯购自宜春大海龟生命科学有限公司，纯度约为92%.抗氧指标化试剂盒购自南京建成生物工程研究所.RNA提取、反转录试剂盒购自日本东洋纺公司.肠道紧密连接蛋白抗体、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)抗体购自ABCAM公司.其余试剂均购自长春华益生物有限公司.

1.2 试验设计

选取24头21日龄早期断奶的三元杂交(杜洛克猪×长白猪×大白猪)仔猪，均为去势雄性.将仔猪随机分为2组，每组6个重复，每个重复2头.A组饲喂基础日粮，B组饲喂基础日粮+250 mg·kg-1角鲨烯.预饲期3 d，正饲期21 d，所有仔猪自由饮水和采食.饲养试验于2020年9月在吉林省四平市梨树市四棵树乡养殖合作社进行.

试验结束时，所有仔猪前腔静脉采血后进行麻醉并处死.打开仔猪腹腔收集空肠样本.将前腔静脉血静止2 h，于3 500 r·min-1、4 ℃条件下离心5 min分离血清，血清分装于冻存管中，干冰预冷后转至120 ℃冻存.使用尼龙线扎紧空肠并剪取空肠样本，使用生理盐水冲洗空肠组织，收集3份空肠样本，每份长度为1～1.5 cm，分别保存于多聚甲醛、PBS缓冲液和液氮中，用于后续检测.

1.3 试验饲粮的配制

基础日粮参考文献[9-10]的方法配制，日粮组成和营养水平如表1所示.

表1 基础日粮组成和营养水平(风干基础)

1.4 指标测定

酶联免疫吸附试验步骤参照试剂盒的说明书进行操作.HE染色切片处理与分析参照沈梦城[11]的方法.尤斯—灌流试验中荧光素异硫氰酸酯—葡聚糖4 kDa(fluorescein isothiocyanate-dextran 4 kDa, FD4)通透性和跨膜电阻测定参照Yin[12]的方法.实时荧光定量PCR中mRNA提取、反转及紧密连接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin mRNA相对表达量的测定参照Zhao et al[13]和Che et al[14]的方法.采用Primer Premier 6.0软件进行PCR引物设计，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列如表2所示.

表2 实时荧光定量PCR引物序列

1.5 数据处理

使用SPSS 22.0软件中的One-Way ANOVA进行数据分析，采用Duncun′s多重比较进行差异显著性检验，以P<0.05作为差异显著性判断标准，试验数据以平均数±标准差表示.

2 结果与分析

2.1 角鲨烯对早期断奶仔猪空肠形态的影响

由表3可知，与A组相比，B组仔猪空肠绒毛高度及绒毛高度与隐窝深度的比值显著提高(P<0.05)，隐窝深度显著下降(P<0.05).A和B组仔猪空肠肠道形态如图1所示.

表3 角鲨烯对早期断奶仔猪空肠形态的影响

图1 早期断奶仔猪空肠形态(100×)

2.2 角鲨烯对早期断奶仔猪空肠黏膜通透性及损伤标识物水平的影响

由表4和表5可知，与A组相比，B组仔猪血清和空肠组织中的二胺氧化酶活性、D-乳酸浓度和再生胰岛衍生蛋白3含量显著下降(P<0.05)，血清中的髓过氧化物酶含量显著下降(P<0.05).在空肠黏膜通透性方面，与A组相比，B组仔猪空肠黏膜FD4通透性显著下降(P<0.05)，跨膜电阻显著提高(P<0.05).

表4 角鲨烯对早期断奶仔猪血清中黏膜损伤标识物水平的影响

2.3 角鲨烯对早期断奶仔猪空肠紧密连接蛋白表达量的影响

由表6可知，与A组相比，B组仔猪空肠组织中ZO-1、Occludin和Claudin基因mRNA的相对表达量均显著提高(P<0.05).由表7可知，在蛋白水平上，B组仔猪空肠组织中ZO-1、Occludin和Claudin蛋白的相对表达量均显著高于A组(P<0.05).

表6 角鲨烯对早期断奶仔猪空肠紧密连接蛋白基因mRNA表达量的影响

表7 角鲨烯对早期断奶仔猪空肠紧密连接蛋白相对表达量的影响

2.4 角鲨烯对早期断奶仔猪空肠抗氧化水平的影响

由表8可知，与A组相比，B组仔猪空肠组织中的丙二醛浓度显著下降(P<0.05)，超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶的活性显著提高(P<0.05).

表8 角鲨烯对早期断奶仔猪空肠抗氧化水平的影响

3 讨论

一般情况下，仔猪断奶日龄多为28～35 d，早期断奶日龄为21 d.早期断奶能够提高母猪的周转率和产房的利用率，降低哺乳期仔猪的生产成本，有利于生物安全防控[15-17].然而，早期断奶仔猪的消化道发育尚不健全，难以发挥其消化和免疫功能，进而影响仔猪的生产性能和生长潜力[15-16,18].研究表明，仔猪断奶引起的肠道氧化损伤会加速肠道上皮细胞凋亡，损伤肠道的结构与功能[19].因此，改善早期断奶仔猪的肠道健康水平，缓解断奶应激对仔猪的生长具有十分积极的意义.研究表明，角鲨烯能够在调节机体抗氧化、抗炎、免疫调节和心血管保护等方面发挥重要作用[8,20].本研究结果表明，在饲粮中添加角鲨烯能显著提高早期断奶仔猪空肠绒毛高度及绒毛高度与隐窝深度的比值，并显著降低隐窝深度.原因可能是，角鲨烯独特的全反式6双键结构赋予其极佳的流动性，能迅速分布在受损的肠道上，发挥其抗炎和抗氧化作用，为肠道绒毛的发育提供有利条件.仔猪空肠绒毛高度及绒毛高度与隐窝深度比值的提高，有利于空肠发挥消化和免疫功能，保证仔猪的生长与健康.

肠道的通透性是评价肠道完整性的重要指标.研究表明，仔猪在应激状态下，机体自由基水平升高[15]，自由基能捕捉并进攻肠黏膜细胞的脂类结构，造成脂质过氧化，导致肠道上皮细胞通透性增大和肠道损伤[21-22].本研究结果显示，在饲粮中添加角鲨烯能显著降低早期断奶仔猪血清和空肠组织中肠道损伤标识物的水平，表明角鲨烯在清除机体自由基方面能够发挥重要作用，维护了仔猪空肠的结构与功能.本研究中，在饲粮添加角鲨烯，仔猪空肠黏膜FD4通透性下降，跨膜电阻提高，血清中的肠道损伤标识物水平下降，说明角鲨烯能显著改善早期断奶仔猪空肠黏膜的通透性，在保护空肠方面发挥重要作用.本研究结果还表明，角鲨烯能显著提高早期断奶仔猪空肠紧密连接蛋白的表达水平，这一结果与空肠形态、空肠黏膜通透性的结果相符.肠道中紧密连接蛋白的表达量与肠道的健康水平密切相关，完整的肠道细胞排列不仅有助于营养物质的吸收，还能发挥重要的屏障功能，有利于缓解断奶应激并增强仔猪的抗逆性.

断奶后，仔猪的营养源从母乳转变为饲料，饲料中的粗纤维虽能刺激肠道发育，但更易造成空肠绒毛损伤[23-24].仔猪空肠组织中的丙二醛浓度能反映氧化损伤程度.研究表明，肉鸡和大鼠补饲角鲨烯能显著降低血清、肝脏和肌肉组织中的丙二醛浓度，并提高超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶等抗氧化酶的活性[8,25-26].其原因可能有两个方面：一方面，角鲨烯通过调控机体多种抗氧化酶活性，实现机体自由基的清除；另一方面，角鲨烯可通过维持三羧酸循环酶和呼吸标记酶的活性，以此改善能量状态并增强线粒体的抗氧化力[26-28].

4 结论

在饲粮中添加250 mg·kg-1角鲨烯可显著改善早期断奶仔猪的空肠形态，有效保护空肠黏膜通透性并提高空肠组织的抗氧化功能.因此，可初步判断角鲨烯在缓解早期断奶仔猪应激和维持肠道健康方面具有积极作用.