犬源大肠杆菌分离株对β-内酰胺类药物耐药性分析及耐药基因检测

赵雪洋，王利豪，张婉婷，黄妮妮，王智豪，刘 帅，周变华

(河南科技大学动物科技学院，河南 洛阳 471000)

随着人们生活方式的改变，越来越多的家庭开始饲养宠物犬，主人和犬的亲密接触，加剧了耐药菌在动物和人类之间的传播。大肠杆菌在人和动物的肠道中普遍存在，属于条件性致病菌[1-2]。大肠杆菌经口感染人或动物数小时后就可以进入消化道后段，在体内大量定居、繁殖，通过粪便传播到环境中[3]，造成细菌在环境中的传播[4]。动物大肠杆菌病的发病率和死亡率都非常高[5]，防治主要依赖于抗菌药物的使用[6]，β-内酰胺类抗生素以其杀菌活性强、毒性低、适应症广及疗效好等优点，被广泛应用于临床。伴随抗生素大量使用，细菌的耐药情况也逐渐凸显[6-8]，宠物与人的密切接触加剧了耐药菌转移给人的风险，对公共卫生安全产生极大的危害[9-10]。本试验开展了犬源大肠杆菌对β-内酰胺类药物敏感性的分析及耐药基因的检测，为兽医临床合理用药提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌株 2018—2019年间从洛阳市宠物医院采集宠物犬直肠肛门拭子样本，采集的样本接种于麦康凯培养基，37 ℃培养24 h，挑选单个菌落接种于伊红美蓝培养基，再挑取伊红美蓝培养基上单菌落进行生化鉴定和16S rDNA测序分析获得大肠杆菌样品40株。质控菌株ATCC 25922，购自中国典型培养物菌种保藏中心。

1.2 主要试剂 麦康凯琼脂培养基、伊红美蓝琼脂培养基、营养琼脂培养基、营养肉汤培养基，药敏纸片(表1)，均购自杭州微生物试剂有限公司；酵母提取物(Yeast extract)和胰蛋白胨(Tryptone)，均购自英国Oxoid公司；DNA Marker、琼脂糖、2×TaqMaster Mix，均购自宝日医生物技术(北京)有限公司。

表1 药敏纸片Table 1 Drug sensitive paper

1.3 药敏试验 以ATCC 25922为质控菌株，依照美国临床和实验室标准化研究所(CLSI)2014版执行标准，采用纸片扩散法(Kirby-Bauer，K-B)对9种β-内酰胺类药物进行药敏试验。

1.4 耐药基因的PCR扩增

1.4.1 细菌基因组DNA的制备 取分离菌纯培养物1 mL于1.5 mL EP管中，12 000 r/min离心5 min，弃上清，50 μL超纯水重悬沉淀，混匀，沸水中煮沸10 min，冷却后，12 000 r/min离心5 min，上清即为细菌基因组DNA模板。

1.4.2 PCR反应 参照 GenBank 中耐药基因的序列，设计7 对引物(表2)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反应体系：DNA模板1 μL，2×TaqMaster Mix 10 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，ddH2O 8 μL，总体系为20 μL。PCR扩增条件：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s、退火温度15 s、72 ℃延伸2 min，共35个循环；最后72 ℃延伸10 min。扩增产物采用1%琼脂糖凝胶电泳进行分析。

表2 PCR扩增引物和条件Table 2 Primers and conditions for PCR amplification

2 结果

2.1 药敏试验 对40株分离的大肠杆菌进行药敏试验，结果如表3所示，大肠杆菌对青霉素类药物氨苄西林、羧苄西林和阿莫西林的耐药率均大于85.0%，其中对氨苄西林的耐药率达到100%；对头孢菌素类药物的耐药率相对较低，对头孢噻肟和头孢吡肟的耐药率为32.5%，对头孢克肟和头孢曲松的耐药率为37.5%，对头孢他啶和头孢西丁的耐药率为15.0%。

表3 大肠杆菌对β-内酰胺类药物的敏感性分析Table 3 β-lactams drug sensitivity analysis in Escherichia coli

2.2 多重耐药性分析 如图1所示，在分离菌株中，全部对至少1种药物耐药，95%的菌株表现出对3种或3种以上抗菌药物同时产生耐药性。有15株菌为3耐，9株菌为4耐，4株菌为5耐，3株菌为6耐，5株菌为7耐，2株菌为9耐。

图1 大肠杆菌的多重耐药性分析Fig.1 Analysis of multiple drug resistance in Escherichia coli

2.3 耐药基因的检测分析 采用PCR扩增技术对分离菌株进行了β-内酰胺类7种耐药基因的检测。其中有14株含有blaDHA，有10株含有blaSHV，有22株含有blaOXA，有22株含有blaCTX-M，40株均含有blaCMY、blaPSE和blaTEM(图2A)。大肠杆菌分离株同时含有不同种类耐药基因的现象严重，有10株含有3种耐药基因，有6株含有4种耐药基因，有12株含有5种耐药基因，有8株含有6种耐药基因，有4株含有7种耐药基因(图2B)。

图2 耐药基因的检测分析Fig.2 Analysis of drug resistance genesA：β-内酰胺类耐药基因型分布情况； B：大肠杆菌含3种以上耐药基因检出情况A：Distribution of β-lactam drugs resistant genotypes； B：Detection of more than three resistance genes in Escherichia coli

3 讨论

大肠杆菌血清型复杂，难以免疫防治，药物防治仍是控制的主要手段，主要包括青霉素类和头孢菌素类的β-内酰胺类广谱半合成抗生素，以其广谱、高效、低毒等优点，被广泛应用于临床。本试验中，大肠杆菌菌株对β-内酰胺类药物的耐药性高，尤其是对青霉素类药物的耐药性较高，其中氨苄西林、羧苄西林和阿莫西林的耐药率分别为100%、85%和 90%，这可能是因为青霉素类药物作为临床上较为早期使用的抗菌药物，随着药物的长期应用促进了耐药菌株的产生，加之药物的不合理使用，导致耐药菌株扩散蔓延，这与之前的报道相一致[11]。

大肠杆菌对β-内酰胺类抗生素产生耐药性的重要机制为质粒介导的AmpC β-内酰胺酶和超广谱β-内酰胺酶的产生，进而水解药物的β-内酰胺环，使酰胺键断裂而失去抗菌活性[12]。根据Bush-Jacoby-Medeiros分类方法，可以将β-内酰胺酶可以分为A、B、C和D四类。本试验发现，犬源大肠杆菌分离株同时对3种以上β-内酰胺类药物耐药的菌株高达95%，出现多药耐药。进一步对7种β-内酰胺酶的编码基因进行分析，结果表明，洛阳市宠物犬源大肠杆菌介导耐药基因主要以blaCMY,blaPSE和blaTEM为主。

综上，洛阳市宠物犬源大肠杆菌对β-内酰胺类抗生素耐药性较高，且具有明显的多药耐药现象。因此，严格执行《兽药管理条例》等法律法规，合理使用抗菌药物，对有效控制和减少耐药性的产生，降低耐药菌株传递给人类的风险，维护公共卫生的安全具有重要意义。