蛋鸡水线绿脓杆菌的分离鉴定、药敏试验和致病性试验

周业飞，张琰杰，柳依灵

(南京晓庄学院食品科学学院，江苏 南京 210017)

目前，密闭式乳头饮水器在我国蛋鸡养殖中被广泛使用，可以有效封闭水源，避免浪费水，提高鸡只饮用水品质[1]。有助于保持鸡舍干燥、减少发酵和氨气的释放，在蛋鸡养殖收益中发挥着重要作用[2]。但长期使用后，饮水管道壁和饮水乳头与管道间隙特别容易滋生细菌，空肠弯曲杆菌、大肠杆菌、假单胞菌和沙门菌等蛋鸡饮用水中常见微生物可通过水线(饮水管道)水传播给蛋鸡，从而给蛋鸡健康养殖造成潜在风险[3]。因此，乳头式密闭式饮水系统的水质是蛋鸡养殖过程中重要质控点之一，一些病原菌可能通过水传播给蛋鸡，因此水线(饮水管道)水的生物安全卫生控制是养殖企业重点关注的问题。

本试验对江苏南京某蛋鸡场水线水采样，并进行细菌分离鉴定、药敏试验和致病性试验，以期为该蛋鸡养殖场乃至该地区临床用药和水质管理提供参考建议和理论依据。

1 材料与方法

1.1 水线水样品 用无菌离心管直接采集江苏南京某规模化蛋鸡养殖场乳头式密闭式饮水系统的水线(饮水管道)水样品10 mL。

1.2 主要试剂 所用培养基、生化反应管，均购自青岛海博生物技术有限公司；PCR试剂，购自生工生物工程(上海)股份有限公司；微量生化鉴定管，购自杭州天和微生物试剂有限公司；药敏纸片(直径6.0 mm)，购自常德比克曼生物有限公司。

1.3 试验动物 50只21日龄雏鸡，购自南京家禽所种禽孵化场。

1.4 试验方法

1.4.1 细菌的分离纯化 无菌蘸取水线样品接种在NAC琼脂培养基，37 ℃培养16 h，观察菌落形态特征，选取典型菌落纯培养再接种于普通营养琼脂、S.S.琼脂和血平板上，37 ℃培养12～24 h。对纯培养的分离株进行革兰染色并镜检，观察菌落形态。

1.4.2 分离菌株的生化鉴定 根据绿脓杆菌常见生化试验进行设计和鉴定。

1.4.3 分离菌株的PCR鉴定 根据已报道[4]的绿脓杆菌外毒素A(ETA)基因序列设计引物，ETA1和ETA2的序列分别为：5′-GACAACGCCCTCAGCATCACCAGC-3′和5′-CGCTGGCCCATTCGCTCCAGCG-CT-3′，扩增该基因上一段369 bp的区域。采用酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提的细菌DNA为模板，PCR反应条件：95 ℃ 预变性2 min；94 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。 将PCR产物送至南京擎科生物科技股份有限公司测序。

1.4.4 药敏试验 利用纸片法进行药敏试验，挑取纯培养的绿脓杆菌单菌落溶于无菌生理盐水中，并均匀涂布于普通营养琼脂平板上，并等距贴上药敏纸片，置37 ℃温箱培养18 h，抑菌环直径判定依据欧盟药敏试验标准(EUCAST)。

1.4.5 致病性试验 挑取纯培养的单菌落溶于无菌PBS中制成菌悬液，按倾注平板培养方法进行活菌计数。将50只21日龄雏鸡随机分成2个组，每组25只。根据预试验结果，对试验组雏鸡采取胸肌注射菌悬液0.2 mL/只(含菌量为3×108CFU/mL)，对照组雏鸡接种无菌PBS 0.2 mL/只。

2 结果

2.1 分离菌株的鉴定及形态观察 从水线水中分离的细菌，在普通营养琼脂培养基上形成表面光滑湿润、微隆、边缘不整齐的黄绿色的菌落(图1)。在S.S.琼脂培养基上有红色单菌落生长(图2)，挑取红色菌落接种在血平板上呈β溶血环，经革兰染色、镜检后确定为革兰阴性杆菌。

图1 普通营养琼脂培养基上菌落形态Fig.1 Colony morphology on common nutrient AGAR medium

图2 S.S.琼脂培养基上红色的单菌落Fig.2 Red single colonies on S.S.AGAR medium

2.2 分离菌株的生化鉴定 分离菌株的生化项目鉴定结果见表1，根据《伯杰细菌鉴定手册》的鉴定标准，初步判定为绿脓杆菌。

表1 分离菌株生化试验结果Table 1 Biochemical test results of isolated strains

2.3 分离菌株的PCR鉴定 PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，获得的目的条带大小与预期相符(图3)。同时测序结果在NCBI上经BLAST对比表明：分离的菌株为绿脓杆菌。

图3 分离菌株PCR鉴定Fig.3 PCR identification of isolated strains1：绿脓杆菌外毒素A(ETA)基因； 2：阴性对照； M：DL-2 000 DNA相对分子质量标准1:ETA gene fragment of isolate; 2:Negative control; M:DL-2 000 DNA marker

2.4 药敏试验 由表2可知，绿脓杆菌分离株对头孢他啶、盐酸左氧氟沙星、硫酸阿米卡星、青霉素钾、环丙沙星较为敏感；对头孢克肟、氟苯尼考、林可霉素、磷霉素钙、盐酸多西环素、阿莫西林、单硫卡耐药性较强。

表2 2株分离株药敏试验结果Table 2 Drug sensitivity test results of 2 isolated strains

2.5 致病性试验 人工感染雏鸡后，试验组雏鸡表现出精神沉郁、食欲不振、拉稀等明显的发病临床症状，发病后期出现震颤或转圈等神经症状。雏鸡在接种后12 h开始死亡，96 h后全部死亡。对死亡的病鸡剖检可见死鸡皮下及胸肌表面附着淡黄色、胶胨样水肿液，病程稍久的死鸡胸肌化脓呈干酪样。早期死亡鸡心包积液，后期死亡鸡可见心包炎。肝脏见出血点，脾脏坏死，肺淤血、水肿。从试验组雏鸡的皮下水肿液、肝脏中均可分离到与原代分离菌株形态特征和生化特性相同的菌株。对照组雏鸡均存活，且无明显临床症状，剖检后无肉眼可见病灶及出血点，细菌回归试验结果为阴性，表明该分离菌对雏鸡具有高度致病性。

3 讨论

饮用水对维持蛋鸡免疫功能和体内电解质平衡至关重要，对蛋鸡的健康发挥重要和持续的作用[5]。通过改善卫生条件，防止水传播疾病，是蛋鸡健康养殖可持续发展目标的一个关键组成部分。目前，在蛋鸡饮用水中常被检出假单胞菌属、葡萄球菌属和大肠杆菌属等微生物群落，也有弯曲杆菌属和沙门菌属等人兽共患病病原体被检出[6-7]。与革兰阳性菌相比，革兰阴性菌的检出率更高，这可能是因为密闭式乳头饮水系统中更适合革兰阴性菌形成微生物生物膜[8]。

绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa,PA)又称铜绿假单胞菌，属假单胞菌属，是一种条件性致病菌，是导致人类条件性感染的三大原因之一，在家禽养殖中也是一种重要的条件性致病菌，在鸡群中可迅速传播，引起较高的死亡率[9-10]。该菌广泛分布于自然界中，是一种多功能的革兰阴性菌，对环境的适应能力和抵抗能力较强，可引起多种动物的脏器出现脓肿现象[11]，主要因为该菌可以产生如黏附素、多糖荚膜和内外毒素等多种致病因子，通过阻遏真核细胞蛋白合成等途径产生有毒物质，并损伤机体的多种组织和器官[12]。有报道称，也会与鸡大肠杆菌、沙门菌和新城疫等病原体混合感染，引起肉鸡的较高死亡率，在蛋鸡养殖业中也是不容忽视的威胁之一，可导致胚胎发育停止或死亡，也会给刚出壳的雏鸡造成局部或全身性疾病[13-14]。近年来，我国蛋鸡养殖业也会受到绿脓杆菌感染的影响，其感染以后发病率呈上升趋势[15]，由于该病在1～5日龄的雏鸡中多发，且感染后多出现各种实质器官损伤，死亡率高，严重制约蛋鸡产业的发展，加上在养殖过程中对于用药的不科学和不合理，导致绿脓杆菌的耐药问题也日益加重[16]。为了对该病的防控和用药等方面有所指导，本试验从蛋鸡水线水中分离出致病性较强的绿脓杆菌，为蛋鸡养殖企业水线消毒剂的种类精准选择提供了可行性理论依据，提醒养殖者重视绿脓杆菌污染造成的潜在危险，保障鸡群饮水水质卫生质量，防止水传播病原菌在蛋鸡群中的流行。

抗菌药物耐药性在家禽细菌感染中具有重要意义，因为它可以使抗菌药物的抗菌效果减弱甚至无效，是造成人类菌群或其他细菌耐药性的一个重要因素[17]。不同地区和不同场所分离的绿脓杆菌也会因为基因型不同或用药量和种类不同而产生多重耐药性[18]。有研究报道[19]从鸡心包炎中分离的绿脓杆菌对阿奇霉素、庆大霉素﹑左氧氟沙星、新霉素和诺氟沙星等高度敏感，对多西环素、环丙沙星、多黏菌素和丁胺卡那霉素等中度敏感，对阿莫西林和氨苄西林等不敏感。本试验通过药敏试验发现，分离的绿脓杆菌对头孢克肟、氟苯尼考、林可霉素、磷霉素钙、盐酸多西环素、阿莫西林、单硫卡耐药性较强。对头孢他啶、盐酸左氧氟沙星、硫酸阿米卡星、青霉素钾、环丙沙星较为敏感。由于环丙沙星、庆大霉素、阿米卡星不存在交叉耐药性[20]，所以可以考虑联合用药。根据药敏试验进行药物筛选和选择合理的药物，是目前蛋鸡养殖精准用药管理的需求，根据农业农村部2019年发布的194号公告，饲料端“禁抗”，养殖端“减抗、限抗”大势已定，而且会越来越严格。因此，除了对密闭式乳头饮水系统的水线水及时和定期消毒外，一旦发现水传播疫情时，应当及时进行临床检测和病原学鉴定，合理使用敏感性药物，交替轮换用药，忌滥用药和乱用药，做好防治工作，将养殖损失降低到最小。