计算机辅助精子分析在大熊猫精子浓度测定的应用

赖燕舞,杨 波,李晓燕,周 强,李 凤,王 群, 唐 勇,唐 诚,谢术红,周应敏,罗 波,黄 炎

(中国大熊猫保护研究中心 大熊猫国家公园珍稀动物保护生物学国家林业和 草原局重点实验室,四川 都江堰 611830)

精子浓度是精液质量评估的一个重要指标，也是指征男性生育能力的最佳标志[1]。自1978年大熊猫(Ailuropodamelanoleuca)人工授精技术首次在北京动物园应用成功以来[2]，人工授精技术已逐渐完善并作为圈养大熊猫人工繁育的重要技术手段，以弥补自然交配的雄性大熊猫数量不足、促进不能自然交配的雄性个体参与繁殖以及提高遗传多样性[3]，而人工授精的成功率与冻精的质量存在重要的关联性[4-6]。精液的精子浓度决定了冻精的稀释比例，一般做1～7倍稀释[7]。因此，精子浓度不仅是衡量雄性大熊猫生殖能力指标，也是影响冻精质量以及人工授精成功率的重要因素。

既往采用常规精液分析(Semen routine analysis,SRA)对精液质量进行评估，该方法是一种传统的分析方法，简单且认可度高，但检测时间较长，人为差异较大。20世纪80年代，计算机辅助精液分析(Computer aided semen analysis，CASA)已开始应用，如今越来越多的运用到公畜繁殖力评估[8]。CASA通过对精子动态图像进行分析，并提供精子动力学的量化数据，检测迅速、客观、精确，已被广泛应用在人类临床精液质量的评估[9]。本试验首次比较CASA与SRA两种方法对大熊猫精子浓度检测的结果是否具有差异性，以评估CASA在大熊猫精液质量分析中的准确性和应用性。

1 材料与方法

1.1 计数工具 全自动精子分析仪(迈朗ML-500 JZ，南宁松景天伦生物科技有限公司)；迈朗CASA精子计数板(板池深度=20 μm)；血细胞计数板(XB-K-25，25×16型，上海)。

1.2 精液的采集 于2018—2019年间，利用直肠电刺激采集14只雄性大熊猫精液，年龄8～20岁，均为参与繁殖的雄性个体。共得到26例大熊猫新鲜精液样本。

1.3 计数方法

1.3.1 全自动精子分析仪 进行CASA时，将大熊猫新鲜精液用生理盐水稀释成1∶25、1∶50或1∶100，每个样本制作2份稀释液。混匀后取10 μl精液于CASA精子计数板池内，放于显微镜载物台上静置1 min，在10×10倍镜下检测。每份稀释样本扫描5～20个视野，至少检测500条精子。分别用自动和手动2种模式进行检测(自动模式：由计算机自动识别精子并进行统计分析；手动模式：人为识别精子并进行标注，再由计算机进行统计)。精子浓度=N1(平均每个视野下的精子个数)×0.386×106×稀释度(25或50或100)。

1.3.2 血细胞计数板计数方法 进行SRA时，参考王亚民[10]使用血细胞计数板对精子进行计数。将1∶25、1∶50或1∶100的稀释精液再稀释成1∶200，同样制作2份稀释液。混匀后加入至血细胞计数板中。对中央大方格进行精子计数(整个计数区)，精子浓度=N2(中央大方格精子个数)×104×200。

1.4 统计分析 计量资料以平均数±标准差(Mean±SD)表示。采用SPSS 22.0软件对数据进行正态分布检验，各组数据均为正态分布，随之进行配对样本t检验，P<0.05表示差异显著，具有统计学意义。

2 结果

2.1 精液稀释度对CASA、SRA检测结果的影响 将1例精液进行1∶5稀释，再依次进行等比稀释，最终稀释成1∶1 280精液，各制作2份。依次对1∶5、1∶10、 1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640和1∶1 280倍共9个稀释度精液进行CASA和SRA分析。结果如图1所示，随着稀释度的增加，CASA(自动模式)所得出的精子浓度也逐渐增大，整体的等比性较差，尤其表现在低稀释度区间(1∶5、1∶10和1∶20)和高稀释度区间(1∶320、1∶640和1∶1 280)。仅在1∶40、1∶80和1∶160稀释度间呈现出较好等比性，所得精子浓度几乎相同，分别为(2 509.0±32.8)×106/mL、(2 501.3±43.7)×106/mL和(2 593.9±87.3)×106/mL。CASA(手动模式)与SRA得出的结果呈现出波浪式波动，整体的等比性均较好。CASA(自动模式)与CASA(手动模式)在1∶40、1∶80、1∶160稀释度间的重叠性较好，所得精子浓度基本相同。3种稀释度下所对应的平均每个视野下的精子个数分别为163/166、81/82、42/42(CASA自动模式/手动模式)。

图1 精液等比稀释后的CASA和SRA分析结果Fig.1 CASA and SRA analysis results under geometric dilution of semen

2.2 CASA与SRA比较 精子浓度在10亿以下的SRA、CASA(自动模式)和CASA(手动模式)检测结果分别为(847.7±302.1)×106/mL、(955.3±408.8)×106/mL和(915.7±350.6)×106/mL；在10亿～20亿精子浓度区间内，检测结果分别为(1 511.9 ±352.0)×106/mL、(1 582.9±393.5)×106/mL和(1 567.4±357.2)×106/mL；精子浓度在20亿以上时，分别为(2 407.4±207.5)×106/mL、(2 840.5±561.9)×106/mL、(2 816±562.7)×106/mL。差异性分析显示(图2)，精子浓度在10亿/mL以下，SRA与CASA(自动模式)和CASA(手动模式)的检测结果均无显著差异性(N<10=5；T<10=-0.916，-0.836；P<10=0.412，0.450)。精子浓度在10亿～20亿/mL范围内，同样不存在显著差异性(N10～20=12；T10～20=-1.265，-1.257；P10～20=0.232，0.235)。而精子浓度在20亿/mL 以上时，SRA与CASA(自动模式)和CASA(手动模式)均存在显著性差异，具有统计学意义(N>20=9；T>20=-2.819，-2.684；P>20=0.023，0.028<0.05)。在3个浓度区间内的CASA(自动模式)与CASA(手动模式)均不存在显著差异性(T<10=1.008，T10～20=0.628，T>20=0.787；P<10=0.370，P10～20=0.543，P>20=0.454)。

图2 精子浓度在不同区间内的结果比较Fig.2 Results comparison of sperm concentration in different intenval*:差异性显著(P<0.05)*:Significant difference (P<0.05)

2.3 大熊猫精子浓度分布 本试验统计了中国大熊猫保护研究中心2006—2020年间参与繁育的雄性大熊猫的精子浓度情况(图3)，共计71例精液样本(包含本试验测定的26例)。精子浓度由SRA分析得出。统计发现，大熊猫精子浓度为(1 715.2±1 134.2)×106/mL，且集中分布在5亿～25亿/mL(各浓度区间的百分比>10%)，占总体的78%以上。其中，10亿～15亿/mL 约占总体的3成。

图3 大熊猫精子浓度分布情况Fig.3 Sperm concentration distribution of giant panda

表1 大熊猫精液稀释度参考(CASA)Table 1 Dilution reference of semen in giant panda by CASA

3 讨论

本试验发现，利用CASA检测精子浓度时，精液的稀释度对检测结果有直接影响。尤其是在自动模式下，当稀释度过低，每个镜下视野中精子个数过多，精子很可能发生重叠，进而影响对精子的识别，会导致结果偏低；稀释度过高，镜下精子数过少，计数误差偏大(标准误增大，图1)。因此，针对于本试验中的CASA系统，将每个视野下的精子个数控制在50～150个，CASA表现出较高的准确性。因此在实际操作中，可参考表1进行精液稀释。

当大熊猫精子浓度在20亿/mL以下时，2种方法检测结果无显著性差异；而当精子浓度>20亿/mL 时，CASA检测结果显著高于SRP。可能是大熊猫精液中含有的巨噬细胞和被吞噬的衰亡精子及其碎片[11]，还包含非精子细胞、细胞碎片或精液内颗粒杂质等(大小与精子头部相仿)，会导致计算机误将其分析为精子，最终测定的结果远大于实际精子浓度，这与高彩凤等[9]得出的结论相似。CASA的自动与手动模式所得结果无差异表明，CASA对精子的识别性较好，可重复性好，而且在自动模式下可以对精子浓度进行快速、准确测定。常规精液分析往往受到检测者技术熟练程度和主观因素的影响，分析时间较长且无法测定精子的微细运动情况。而CASA很好地克服了主观因素，不仅能够客观、快速地测定精子浓度与活力等质量参数，而且还能显示单个精子的运动轨迹，提供精子动力学的量化数据，如直线/曲线速率、直线性、向前性、侧摆幅度、鞭打频率等，为精液质量评估提供更多的客观参考指标[12-13]。因此，CASA在精液分析方面比传统方法具有优越性。但是，CASA仍然存在一定的局限性，不能完全取代人工计数法。CASA在检查过程中易受到诸多因素的影响，包括图像清晰度、精液颗粒杂质情况、精子浓度、精液稀释度、操作者熟练程度等，故CASA还需要进一步优化系统参数、熟练操作并同时结合常规分析方法，以确保检测的精确性。

大熊猫精子浓度为(1 715.2±1 134.2)×106/mL，这与黄炎等[3,14-15]报道的结果相一致。相比其他动物而言，如非洲狮(Pantheraleo)的精子浓度为1.94×109/mL[16]、亚洲黑熊(Ursusthibetanus)为(13.90±8.19)×108/mL[17]、北极狐(Vulpeslagopus)为(1.95±1.07)×108/mL[18]、美洲豹(Pantheraonca)为(6.20±3.03)×106/mL[19]、云豹(Neofelisnebulosa)为2.7×106～8×106/mL[20]，大熊猫的精子浓度表现出很高的水平。而大熊猫精液中高水平的精子浓度，很可能是一种繁殖策略，以提高雌性个体的怀孕率，能够产下后代。单从精子浓度上讲，大熊猫可能拥有着不弱的生殖能力。

本试验尝试将CASA应用到大熊猫精子浓度分析，且表现出较好的应用性。同时，本试验也为今后拓展大熊猫精液质量分析和精液质量控制标准，以及大熊猫精液质量评估体系的建立打下基础。