从大约克猪乳中提取DNA用于mtDNA D-loop序列分析

张建梅，黄卫平，金素钰，邹 桐，黄 林，郑玉才

(1.西南民族大学畜牧兽医学院，四川 成都 610041；2.四川省凉山彝族自治州畜牧科学研究所，四川 西昌 615042)

线粒体DNA(mtDNA)是重要的核外遗传物质，遵循严格的母系遗传，具有分子结构简单、突变率高、进化速率快、几乎不发生重组等特征[1]，能保存群体多数中性突变[2].mtDNA的D-loop区的序列和长度变异最大，进化速度是其他区域的5～10倍，在进化中积累了较多的突变，如碱基替换、插入或缺失及串联重复序[3-4].因此，mtDNA的D-loop区是研究畜禽群体间的遗传分化的理想分子标记[5].

有关猪mtDNA研究所需的基因组DNA一般是从血液中提取[6-8]，乳中体细胞数量低于血液中的白细胞浓度，但仍可用于提取DNA.崔艳华等[9]用高盐法从50 mL牦牛乳中提取DNA；王一凡等[10]建立了用试剂盒从10 mL牛奶中提取DNA方法；Liu等[11]用丙酮和SDS-苯酚法从13 mL牛乳中提取DNA.综上所述，目前从乳中提取DNA的方法各异，但都存在耗时长、试剂价格高、样本需要量大和试剂污染等问题.本实验从四川省凉山州的大约克猪乳中用Chelex-100法提取基因组DNA，并用PCR方法扩增其mtDNA D-loop区部分序列，测序后分析该区域序列多态性，以丰富该猪品种群体遗传多样性的研究资料.

1 材料与方法

1.1 材料

本实验中健康的大约克猪(n＝30)来自四川省凉山州某种猪场，个体间无亲缘关系.每头猪肌肉注射10 IU催产素后，分别手工挤奶采集乳样约5 mL.乳样冰冻后用冰瓶带回实验室，保存于-80℃，用于基因组DNA的提取.

1.2 基因组DNA的提取

采用Chelex-100的方法[12]从每头试验猪全乳中提取基因组DNA，其中乳样参照罗卉卉等的方法[13]，取样体积为20 μL.提取的基因组DNA保存于-20℃.

1.3 引物设计、PCR扩增和测序

扩增大约克猪mtDNA D-loop区的引物序列及PCR程序参照Zhang等的报道[14]，引物序列:F:5‘-CCAAAAACAAAGCAGAGTGTAC-3‘；R:5‘-CGTTATGAGCTACCGTTATA-3‘，预 期 扩 增 片 段 长431bp，引物使用前稀释至10 μmol/L.

PCR扩增体系为25 μL:3μL基因组DNA，上下游引物各1 μL，Golden Star T6 Super PCR Mix 20 μL.用2.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物后，将条带单一、明亮的PCR产物送生物技术有限公司进行反向测序.

1.4 数据分析

测序结果用DNAMAN软件排列同源序列，并进行人工核对校正.通过与GenBank中猪mtDNA Dloop序列(登录号AF034253)比对，用DnaSP 5.0软件统计单倍型多样度(Hd)、核苷酸多样度(Pi)和平均核苷酸差异度(K)等，并进行Tajima’s D检测.

用Mega 7.0分析所获序列的单倍型数、平均碱基组成、多态位点数及采用邻接法(NJ)构建大约克猪与GenBank中下载的30个猪品种mtDNA D-loop序列(表1)进化树，分析大约克猪与国内外其他猪品种的进化关系.

表1 本研究使用的GenBank数据库中猪的mtDNA信息Table 1 Information of pig mtDNA in GenBank used in this study

2 结果

2.1 大约克猪mtDNA D-loop区的扩增

从乳中提取的大约克猪基因组DNA用PCR扩增，产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，发现其中19个样本的扩增产物条带明亮，其他11个样本经45个循环的PCR扩增后，也获得了明亮的条带.获得的PCR产物约430 bp，与预期的产物大小相符，且特异性良好、亮度较高，可用于后续的PCR产物直接测序(图1).

图1 大约克猪mtDNA D-loop区PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳注:1～8为不同个体的PCR扩增产物；M为DL-2000MarkerFig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR products amplifying mtDNA D-loop of Yorkshire pigs Notes:1 to 8 are PCR products of different individuals；M.DL-2000 Marker

2.2 PCR产物测序结果

实验获得的PCR产物直接测序图清晰，30个样本的扩增序列去除引物及两端不准确区域后，有效序列为364 bp(图2)，说明本实验有效扩增出大约克猪的mtDNA D-loop区部分序列.

图2 大约克猪mtDNA D-loop部分区测序峰图Fig.2 Sequencing map of partial mtDNA D-loop of a Yorkshire pig

2.3 大约克猪mtDNA D-loop区遗传多样性

对本次实验所测30个大约克猪mtDNA D-loop区序列(364 bp)进行了比对，界定了Hap1～Hap7共7种单倍型(表2)，其中特有单倍型为3种(Hap1、Hap6、Hap7)，共享单倍型为4种(Hap2、Hap3、Hap4、Hap5)，Hap3所占比例最高；发现了11个多态位点，其中简约信息位点9个，单一多态位点2个，表现出较丰富的多态性；mtDNA D-loop序列中4种碱基T、C、A和G的平均含量分别为25.0%、25.7%、37.6%和11.7%，其中A＋T含量(62.6%)明显高于C＋G含量(37.4%)，符合mtDNA D-loop区富含A/T碱基的特征.

表2 大约克猪7种单倍型mtDNA D-loop区变异位点Table 2 Mutations in mtDNA D-loop region in 7 haplotypes of Yorkshire pigs

在本研究中，1头猪mtDNA D-loop为Hap1单倍型，其中存在11个碱基(CTTATAAAACA)组成的重复序列，重复1次(图3).30个大约克猪mtDNA D-loop区单倍型多样度(Hd)为0.618，核苷酸多样度(Pi)为0.00860，平均核苷酸差异度(K)为3.103.对大约克猪mtDNA D-loop区序列进行中性检测，其Tajima’s D值为0.37882，差异不显著(P＞0.10).

图3 大约克猪mtDNA D-loop的Hap1单倍型中11 bp重复序列注:1～12为不同个体的序列Fig.3 A 11 bp repeat in Hap1 haplotype of mtDNA D-loop of Yorkshire pigs Notes:1 to 12 are sequences of different individual

2.4 大约克猪mtDNA D-loop区单倍型的系统发育树构建

本研究利用Mega 7.0软件采用邻接法(NJ)以猪獾(HM106329)和河马(AP003425)的mtDNA Dloop序列为外群，构建大约克猪与国内外30个猪品种的mtDNA D-loop序列分子系统发育树(图4).所测样本分为2个明显相对独立的支系:第一支以国外猪品种为主，东北野猪、DLY三元猪、汉普郡猪、杜洛克猪和皮特兰猪聚为一类；第二支以中国地方品猪种为代表的亚洲类群聚为一类.其中大约克猪有3个单倍型(Hap4、Hap6、Hap7)与中国地方猪品种隆林猪、陆川猪、民猪和屯昌猪聚在一起.

图4 试验大约克猪7个单倍型和国内外30个猪品种基于mtDNA D-loop部分序列构建的NJ分子进化树Fig.4 NJ molecular evolutionary tree constructed based on mtDNA D-loop partial sequences of 7 haplotypes of the experimental Yorkshire pigs and 30 domestic and foreign pig breeds

3 讨论

本研究建立了从大约克猪乳中快速提取基因组DNA扩增mtDNA D-loop区的方法.在30个样品中，有19个样本的扩增产物用琼脂糖电泳检测显示扩增条带明亮，另外11个样本的扩增条带亮度较低.这可能与个体差异有关，不同样品提取的基因组DNA含量或质量不同.张军伟[15]比较从荷斯坦牛乳样和血样中提取基因组DNA效果，发现以乳样或血样提取的DNA为模板，PCR扩增效果一样，只是不同个体的乳样提取的基因组DNA浓度相差较大.本研究对11个PCR条带亮度较低的，将PCR循环数增加到45个循环后，发现条带亮度得到明显改善，PCR产物可满足直接测序的要求.虽然在生产实践中从组织和血液中提取DNA是一项比较成熟的技术，但会对动物产生应激反应而产生一些弊端.本研究建立了从大约克猪乳中提取基因组DNA扩增mtDNA D-loop区的方法，具有取样方便、程序简单、成本低等优点.但也存在一些不足，例如，提取的基因组DNA浓度不稳定，PCR扩增时需根据实际情况对循环数进行调整，且该方法仅适合泌乳动物.Amills等从乳中提取基因组DNA扩增基因时，也对不同基因使用的PCR循环数进行过调整[12].

本实验中对30头大约克猪mtDNA D-loop区进行分析，单倍型多样度(Hd)及核苷酸多样度(Pi)分别为0.618和0.00860，显示出其母系遗传多样性较为丰富.张冰等[16]研究的大约克猪Hd和Pi分别为0.762和0.00763，与本实验结果一致，说明该群体大约克猪遗传多样性较高.通过mtDNA序列构建发育树为大约克猪的选育提供参考.本实验构建的NJ树显示，以中国地方猪品种和国外猪品种为代表的几个猪品种分别聚为两个独立的分支，并且东北野猪没有与国内猪品种聚为一类，而是与欧洲猪品种亲缘关系较近，这可能与东北地理位置有关，种群间存在基因交流[17]，这与前人研究结果一致[18-20].