羊痘病毒宿主范围基因063缺失表达载体的构建

2022-01-14柳璇高娜王玉婷张成李有文

塔里木大学学报 2021年4期

柳璇，高娜，王玉婷，张成，李有文*

（1塔里木大学动物科学学院，新疆阿拉尔 843300）（2新疆生产建设兵团塔里木动物疫病诊断与防控工程实验室，新疆阿拉尔 843300）

羊痘是由羊痘病毒感染山羊、绵羊和牛等反刍动物引起的一种烈性传染病。病畜以发热、全身起痘为典型特征［1］，羊群感染后有极高的死亡率，对养羊业及国际贸易造成巨大的经济损失。羊痘病毒属的三个成员均表现严格的宿主范围限制，通常只感染相应的本病动物，但近年来羊痘病毒跨物种感染的现象时有报道，甚至有羊痘病毒感染人的报道［2］，说明羊痘病毒的组织嗜性在发生改变，存在跨物种感染或传播的风险。目前对于痘病毒的研究主要集中在痘苗病毒上，而有关宿主范围因子（Hrf）的研究才刚起步［3］，对羊痘病毒Hrf的了解也是由痘苗病毒Hrf的同系物推测得到，并无实验室研究结果。

痘病毒在长期进化过程中，已衍化出一组特有的针对靶细胞抗病毒信号途径起作用的蛋白，这些蛋白称之为Hrf，编码这些Hrf的基因称为Hrg［3］。痘病毒Hrf与宿主细胞抗病毒之间的互作动态决定其能否发生感染，即Hrf通过调节靶细胞的酶活性，抑制细胞凋亡，对抗干扰素作用等，为病毒的增值提供适宜的微环境。目前对于痘病毒Hrf调控干扰素的机制较为清楚，但对宿主细胞其他信号通路的调控还需深入研究［4］。有研究发现，已知的多种痘病毒的Hrf不仅影响病毒的毒力，而且决定了感染宿主的范围［5］。到目前为止，已经发现15个基因具有痘病毒宿主范围功能，根据功能特征将其分成12个基因家族，但没有一个Hrg同时存在于所有痘病毒中［6］。

羊痘病毒063基因是痘苗病毒Hrf C7L的同系物［5］，因此推断063基因可能是羊痘病毒的Hrf，但还需进一步证实。羊痘病毒063基因位于病毒基因组的核心区域，一般认为核心区域基因的功能主要与病毒生长繁殖必需的功能蛋白表达有关，而两侧翼区的基因则主要表达与病毒毒力和宿主范围有关的蛋白［7］，因此位于核心区的063基因成为Hrg以及其所起的作用就成为很多学者关注的问题。为了研究063基因Hrf的功能及生物特性，构建063基因缺失的重组羊痘病毒非常关键。本研究构建了Hrf 063基因缺失的表达载体，通过同源重组得到了063基因缺失的重组羊痘病毒，虽未得到纯化的重组病毒，但初步了解了羊痘病毒063基因的生物学特性，为进一步研究羊痘病毒Hrf奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 毒株、菌株和细胞

PEGFP-SP质粒、克隆载体PEASY-T1 Cloning-Vector、大肠杆菌DH5α感受态细胞、羔羊睾丸原代细胞和课题组前期收藏的山羊痘病毒SS株、TS株以及疫苗株均保藏于塔里木大学畜牧科技重点实验室。

1.1.2 主要药品及试剂

2×EasyTaq PCR SuperMix、Trans 2K DNA Marker，购自大连宝生物科技有限公司；PEASY-T1 Cloning Vector载体，购自北京全式金生物技术有限公司；BamHI、XhoI限制性内切酶、Golden View/loading buffer，购自Thermo公司；DNA纯化回收试剂盒、质粒小提试剂盒，购自北京天根生物工程技术服务有限公司。

1.1.3 主要使用仪器

SW-CJ-2FD超净工作台（上海博讯实业有限公司），小型台式微量离心机（eppendorf），梯度PCR仪（Bio-Rad生命科学有限公司），DYY-7C型琼脂糖水平电泳仪（北京市六一仪器厂），GEL DOC XR+凝胶成像系统（Bio-Rad生命科学有限公司），ZXGPB2160隔水恒温式培养箱（上海智城分析仪器制造有限公司），ZWYR-200D台式恒温摇床（上海智城分析仪器制造有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 引物设计

根据GenBank中已公布的山羊痘病毒Pellor株（GeneID：5228351)中063基因60 bp的侧翼序列及GFP序列，运用Primer Premie 6.0软件设计overlap PCR特异引物，并将其送至武汉天一辉远生物有限公司进行合成，引物序列如表1所示。

表1 特异引物

1.2.2 GFPΔ063基因扩增、鉴定与回收

PCR扩增反应体系：浓度为10 μmol/L的上下游引物各2.4 μL，2×EasyTaq PCR SuperMix 50 μL，模板（PEGFP-SP质粒）6 μL，ddH2O 39.2 μL，总反应体系100 μL。PCR反应程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s；50 ℃30 s；72 ℃ 90 s；35个总循环；72 ℃ 10 min；12℃自动保存。反应结束后将PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定回收，用实验室购买的DNA纯化回收试剂盒（按照说明书进行操作）回收所需要的目的基因片段。

1.2.3 基因缺失表达载体的构建

将回收的GFPΔ063基因与PEASY-T1 CloningVector载体按照下列体系进行连接反应：GFPΔ0634 μL，载体（PEASY-T1 Cloning Vector）0.5 μL，ddH2O 0.5 μL，反应总体系5 μL，在梯度PCR仪中25℃控温连接30 min。将连接产物转化于大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于AMP抗性的培养基上过夜培养，挑取单菌落进行菌液PCR初步鉴定，对阳性菌落摇菌培养提取质粒（按照质粒小提试剂盒说明书操作）。

1.2.4 重组质粒的双酶切鉴定

将提取的PEASY-Δ063-GFP重组质粒分别使用限制性内切酶BamHI、XhoI 37℃水浴酶切3～4 h。酶切体系：质粒5 μL，Thermo Scientific10×Buffer Tango 1 μL，BamHI、XhoI各 0.5 μL，ddH2O 3 μL，总反应体系10 μL，反应结束后用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，经酶切鉴定正确的质粒送去武汉天一辉远生物有限公司测序。

1.2.5 病毒重组

复苏一支冻存的羔羊睾丸原代细胞，生长良好后传代于12孔细胞培养板中，在37℃、5%的CO2培养箱中培养，培养至单层细胞长至80%～90%时，吸取培养液，用PBS洗3次。接种山羊痘病毒10 μL（IgTCID50=10-4.375/0.1 mL），37 ℃吸附1 h，吸弃病毒液，加入含2%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基，在37℃、5%的CO2培养箱中培养12 h。用脂质体Lipofectamine 2000转染PEASY-Δ063-GFP重组质粒，参考米丽开姆·托合提尼亚孜［8］的方法，并于转染后24 h、36 h、48 h分别置于倒置荧光显微镜下观察细胞生长情况，并挑取荧光斑点。

1.2.6 重组病毒的纯化筛选

将以上重组的063基因缺失带荧光的SS株、TS株和疫苗株重组病毒分别进行10-1～10-10的倍比稀释，分别接种至培养密度90%的羔羊睾丸原代细胞，添加含有2%FBS和100 ug/mL双抗的DMEM培养基，在37℃、5% 的CO2培养箱中培养2～3 d，并适时观察，待最强荧光斑点出现，吸取上清液，加入用2%FBS的DMEM培养基配制的低熔点琼脂糖固定，在倒置荧光显微镜下挑取带有荧光的斑点，特别是高稀释倍数孔中的荧光斑点，反复冻融后，将带荧光培养物进行倍比稀释，再接种羔羊睾丸原代细胞，挑取荧光，如此重复至重组病毒纯化。

2 结果

2.1 GFPΔ063基因PCR扩增鉴定

GFPΔ063基因PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳仪鉴定得到大小为900 bp条带，与预测结果一致（如图1所示）。

图1 羊痘病毒GFPΔ063基因PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳鉴定结果

2.2 重组质粒的双酶切鉴定

将GFPΔ063基因与载体的连接产物经菌液PCR鉴定阳性的PEASY-Δ063-GFP重组质粒做BamHI、XhoI双酶切鉴定，电泳结果显示有4000 bp与900 bp大小的两个条带（如图2所示），与理论相符，测序结果表明载体构建正确。

图2 羊痘病毒PEASY-Δ063-GFP重组质粒双酶切鉴定结果

2.3 病毒重组、重组病毒纯化筛选

1）将培养好的羔羊睾丸原代细胞在12孔细胞板中传代，培养至单层细胞密度为80%～90%，细胞呈梭形贴壁生长时（如图3所示），接种山羊痘病毒，培养48 h后，细胞形态拉长、间隙变大，病毒在细胞中生长良好（如图4所示）。

图3 羔羊睾丸原代细胞培养结果

图4 接种山羊痘病毒的羔羊睾丸原代细胞培养结果

2）将PEASY-Δ063-GFP重组质粒转染到羊痘病毒感染的羔羊睾丸原代细胞中，5～6 h后换液，分别在12 h、24 h、48 h观察重组结果。发现只有PEASY-Δ063-GFP重组质粒转入羊痘病毒感染的羔羊睾丸原代细胞得到了荧光场带有荧光斑点的SS株、TS株、疫苗株063基因缺失的重组病毒（如图5所示）。挑取倒置显微镜下带有荧光的重组病毒斑点，倍比稀释后接种细胞传代纯化重组病毒。结果传代病毒没有表达荧光，表明重组病毒传代无法形成子代病毒，最终未能得到纯化的重组病毒。

图5 SS株、TS株、疫苗株063基因缺失的重组病毒结果

3 讨论

本研究根据已在GenBank上发表的山羊痘病毒株（登录号为NC004003.1）中063基因序列及其两侧的侧翼序列（约60 bp）与GFP基因上下游特异引物组成overlap PCR的引物，扩增GFP基因，将其插入克隆载体中作为构建重组病毒表达载体的报告基因。这种构建方法是直接用报告基因GFP替换掉了063基因，以063基因本身的启动子作为重组病毒报告系统的启动子，一方面简化构建过程，不需要专门扩增克隆报告基因的启动子；另一方面GFP作为报告基因，其表达的荧光容易观察，只要在荧光显微镜下观察到绿色荧光就可以证明重组成功。

一般认为在构建重组表达载体时，同源臂越长重组效率越高，但同源臂越长，构建过程也会越复杂。杨勇飞等［9］研究ANK基因时选用约300 bp的同源臂，用Overlap PCR的方法经过3步扩增才得到报告系统。本研究中用了约60 bp的同源臂，利用Overlap PCR的方法1步就得到了报告基因系统，较大的简化了步骤。重组结果显示，本次构建的重组病毒表达载体转染羊痘病毒感染的羔羊睾丸原代细胞后，得到大量带有绿色荧光的细胞，且荧光强度较高，说明表达载体与病毒基因组发生了重组，并使报告基因得到了表达，此结果甚至比杨勇飞等［9］选用同源臂为300 bp表达载体重组的效率还要高，说明对构建同源重组病毒来讲，同源臂的长度达到60 bp就可以构建成功。同源重组中同源臂的长度不是影响重组效率的绝对因素，可能同源臂的相似性、目的基因的特性起着更为重要的作用，在重组病毒时需要全面分析。

另外，重组病毒的稳定性对于得到一株重组病毒非常重要。在本研究中，063基因的重组表达载体虽然转染后得到了高效表达的GFP，且在3个羊痘病毒株上得到了相同的结果，但当挑取荧光斑点进行传代纯化时却无法得到表达的荧光和纯化的063基因缺失的重组病毒。经分析认为可能与063基因本身的生物学特性有关系，该基因位于病毒基因组核心区，若被破坏或缺失可能会导致病毒不能正常生长繁殖，或者基因组中编码结构蛋白的区域被敲除，使病毒缺失了增殖所必需的衣壳或囊膜，从而直接导致病毒不能正常出膜［10］，不能形成子代病毒；也可能与决定病毒的细胞嗜性方面有关。前人通过粘液瘤病毒C7L同源序列的M062R、M063R和M064R的敲除试验表明，M063R的缺失影响病毒在兔源细胞系的复制，而M062R缺失影响其在BG-MK、RK13、RL-5和人源细胞中的复制［11-12］。经重组病毒研究证实，重组M062RDE VACV（C7L和K1L缺失性）可以拯救M062RDE VACV在鼠3T3、Hela和A431细胞中的复制，但无法实现M063R和M064R的复制，表明这三者在决定病毒的细胞嗜性方面存在差异［13］，这种嗜性不仅受病毒自身编码的Hrf决定，也与病原和宿主间的相互作用有关［5］。本研究中063基因缺失的重组病毒，可能因063 Hrg缺失而影响了病毒增值的功能，降低了病毒对细胞的嗜性，导致重组病毒不能正常形成子代病毒。几乎所有的痘病毒都能结合并入侵哺乳动物细胞，其入胞后下游的一系列胞内事件决定了病毒复制的限制性［14-15］。

相比较张雪萍［16］和米丽开姆·托合提尼亚孜［8］使用同样的方法分别得到了ANK141.2基因和KLP2基因缺失并纯化的重组羊痘病毒，二者均为病毒侧翼区的非必需基因，能在传代纯化中正常增值形成子代病毒。位于核心区063基因可能因其是Hrg，该基因缺失将导致重组病毒无法正常传代纯化，形成子代病毒，但在重组表达载体转染被羊痘病毒感染的细胞后能够产生大量带荧光的细胞，可能是重组表达载体中的报告基因在细胞中与羊痘病毒基因组发生了重组，并且该重组的基因片段也在病毒自身酶调节和细胞的表达系统中进行了转录和翻译并表达出了GFP，但在病毒包装出膜的过程中，重组的基因能否被顺利包装形成成熟的病毒粒子，在形成的病毒粒子中能否正常发挥生物功能都无法确定，也可能是重组病毒在子代复制重组时和之前感染细胞的病毒发生了重组形成返祖结果［17］，出现了与本研究一样的结果。表明，构建重组病毒时，初次转染就能观察到病毒重组的现象并不困难，但是能够得到传代并纯化的重组病毒才更为重要。