枸橼酸西地那非凝胶剂基质考察及体外溶出度测定*

姜孙旻，吴雪青，袁文博，余仁强，陆子红，姚 荧**

1 南京医科大学附属无锡妇幼保健院 药学部，无锡 214002;2 江南大学 药学院，无锡 214000;3 南京医科大学附属无锡妇幼保健院新生儿科，无锡 214002；

近年来由于极低或超低体重出生儿存活率增加，支气管肺发育不良并发的新生儿持续肺动脉高压（persistent pulmonaryhypertension of the newbom，PPHN）成为儿科常见的危急重症[1]。使用西地那非可以增加血管平滑肌cGMP，使NO 通路的血管扩张效果持续，对于PPHN 具有较好的疗效[2]。目前枸橼酸西地那非的市售制剂仅有口服片剂和口服混悬液，在临床上通过称量、饮用水分散后给新生儿服用。该方法存在操作繁琐、给药剂量不准确、易使疗效降低等不足；此外，新生儿吞咽困难，临床使用还存在易发生呛咽等缺点[3]。因此，很有必要研发一种易于小儿服用的西地那非新剂型药物。故采用明胶-蔗糖作为基质制备西地那非凝胶剂，既能够包裹药物、掩盖苦味、准确给药，又有利于小儿的吞咽，提高患者的顺应性，改善药物的疗效。

1 材 料

1.1 主要仪器

Agilent 1260 高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；A560 型双光束紫外可见分光光度计（翱艺仪器上海有限公司）；BSA124S 电子天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司）；FE20 pH 计（梅特勒-托利仪器上海有限公司）；KQ-200KDE 型高功率数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Centrifuge 5424R 高速冷冻离心机（德国Eppendorf 公司）；Hybrid Discovery HR-3 流变仪（美国TA 仪器有限公司）；RC806D 溶出试验仪（天大天发科技有限公司）。

1.2 药品与试剂

枸橼酸西地那非（Hetero Drug Ltd，批号：SD 18 090085；纯度99.3%）；明胶为化学纯；卡拉胶为药用级；食用蔗糖；常用有机溶剂为分析纯；所用试剂均为色谱纯；水为纯净水。

2 方法与结果

2.1 枸橼酸西地那非分析方法学的建立

2.1.1 溶液的配制 ①流动相：三乙胺（取7 mL 三乙胺，用水稀释至1000 mL，磷酸调节pH 值至3.0）-甲醇-乙腈（58∶25∶17，V∶V∶V）为流动相。②枸橼酸西地那非对照品溶液Ⅰ：精密称取枸橼酸西地那非原料药35 mg 置50 mL 量瓶中，用以上述流动相作为溶剂稀释至刻度，再从中精密量取2 mL 于50 mL量瓶中，稀释至刻度，用0.45 μm 尼龙滤膜过滤，得到质量浓度为28 μg·mL-1对照品溶液[4]。③枸橼酸西地那非对照品溶液Ⅱ：精密称取枸橼酸西地那非原料药50 mg 置50 mL 量瓶中，以流动相作为溶剂，稀释至刻度，从中精密量取5 mL 于50 mL 量瓶中，再稀释至刻度，用0.45 μm 尼龙滤膜过滤，得到质量浓度为100 μg·mL-1对照品溶液。

2.1.2 最大紫外吸收波长的确定 取枸橼酸西地那非对照品溶液Ⅰ，使用紫外分光光度计将其在波长200～400 nm 范围内进行紫外全波长扫描，测定其紫外吸收，确定最大吸收波长，以此确定HPLC 法的最佳检测波长，结果见图1。因在190～210 nm 处很多溶剂都有末端吸收，故选择290 nm 为枸橼酸西地那非的检测波长。

图1 枸橼酸西地那非紫外可见光光谱图

2.1.3 色谱条件 参考《美国药典》（USP 40）[5]，采用高效液相色谱法进行测定。色谱柱：ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：三乙胺-甲醇-乙腈（58∶25∶17，V∶V∶V）；柱温：30 ℃；检测波长：290 nm；流速：1.0 mL·min-1；进样量：20 μL。

2.1.4 专属性 按“2.1.1”项下配制流动相作为空白溶剂与枸橼酸西地那非对照品溶液Ⅱ，按“2.1.3”项下色谱条件进样分析，记录色谱图，结果见图2。由图2 显示，空白溶剂不干扰枸橼酸西地那非的检测，枸橼酸西地那非色谱峰与相邻色谱峰分离良好，表明该色谱条件专属性良好。

图2 枸橼酸西地那非专属性图

2.1.5 标准曲线建立 取对照品溶液Ⅱ，用流动相稀释配制成系列梯度浓度的线性工作溶液（100、80、60、40、30、20、10、5 μg·mL-1），以10 000 r·min-1离心10 min，取上清液，按“2.1.3”项下色谱条件进样分析，记录色谱图与峰面积。以峰面积（Y）对系列浓度（X，μg·mL-1）绘制线性回归的标准曲线，得回归方程为Y=25.58X-2.9823（r2=0.999 7）。结果表明，枸橼酸西地那非在浓度5.22～104.40 μg·mL-1的范围内线性关系良好。

2.1.6 仪器精密度 取枸橼酸西地那非对照品溶液Ⅱ，按“2.1.3”项下色谱条件连续进样6 次，记录相应峰面积。枸橼酸西地那非峰面积的RSD 为0.40%（n=6）。RSD＜2%，表明仪器精密度良好。

2.1.7 方法精密度 配制5、30、80 μg·mL-1浓度的枸橼酸西地那非溶液，低、中、高3 个浓度各配制3份，按“2.1.3”项下色谱条件进样分析，记录相应峰面积。结果显示，低、中、高浓度的RSD 分别为1.37%、0.30%、1.93%（均n=3）。RSD 均＜2%，说明方法精密度良好。

2.1.8 稳定性试验 取枸橼酸西地那非对照品溶液Ⅱ，密封于室温下放置0、24、48 h，按“2.1.3”项下色谱条件进样分析，记录相应峰面积。计算枸橼酸西地那非稳定性试验RSD 为0.166%（n=3）。RSD＜2%，表明枸橼酸西地那非对照品溶液在室温下48 h内基本稳定。

2.2 凝胶基质的处方工艺考察

2.2.1 增溶剂的选择 选择3 种常用的增溶剂泊洛沙姆F68、泊洛沙姆F127 和聚乙二醇4000（PEG4000）进行增溶试验，分别测定增溶剂用量为1%、2%、5%时的枸橼酸西地那非的溶解度，结果见表1。最终选择5%的泊洛沙姆F127 溶液作为处方的增溶剂。

表1 枸橼酸西地那非溶解度

2.2.2 凝胶基质的选择 通过查阅相关文献[6，7]，以及对不同凝胶剂的性价比进行调研后，选择明胶（10%、12%、14%、16%、18%（w/V））和卡拉胶（0.5%、1%、2%（w/V））进行感观评价，以选择较优的凝胶基质与用量。制定感官评分标准：请10 名（5 男5 女）评价员[8]根据透明度、细腻度、强度、气味进行评分，各项分别占20、30、20、30 分，取其平均值作为最终评分结果，满分为100 分。结果表明，明胶基质色泽明亮，质地均匀光滑、粘弹性适度、无特殊气味，其得分均高于卡拉胶，故更适合作为吞咽困难患者服用的凝胶基质。

2.2.3 凝胶基质持水性试验 取不同质量浓度的明胶溶液1 mL 于1.5 mL EP 管中，待其胶凝后称重，放置冷冻高速离心机中，以10 000 r·min-1离心20 min，吸去上层析出的水分，再次称重，按公式（1）计算其持水力（water holding capacity，WHC）[9]。

式中：M1为离心前装有凝胶的离心管质量（g）；M2为吸去水分后离心管质量（g）。

每个样品平行制备3 份，见图3。结果表明，明胶浓度为10%时具有较高的持水性，能够避免制剂在口腔黏膜上粘附。

2.2.4 基质粘弹性试验 将不同质量浓度的明胶基质制备成直径为50 mm、厚度为5 mm 的圆形薄片，选用型号104717，锥角为4∶0∶43（deg∶min∶sec），锥板直径为40 mm，截断参数为109 μm 的锥板夹具，用HR-3 流变仪在流动模式下进行动态频率测试，扫描频率为0.1～100 rad·s-1，仪器平衡时间为5 s，样品测试平均时间为30 s，所有测试均在常温（25 ℃）条件下进行。按照公式（2）[10]计算损耗因子。

式中：tan δ 为损耗因子；G″为损耗模量（Pa）；G′为储能模量（Pa）。

每个样品平行做3 次，结果见图4。由图4 显示，在0.1～100 rad·s-1范围内，所测样品的G′均比G″大一个数量级，tan δ 小于1，并且随着角频率ω的增加，所测样品的tan δ 都略有增加。这表示所测样品的动态模式中，弹性（固体特征）均高于粘性（液体特征），并且通过剪切可降低样品的弹性。在5种浓度的样品中，10%明胶基质具有更低的tanδ，说明此浓度下的明胶基质粘性小，弹性大，能够在挤压时减轻患者的服用负荷。

2.2.5 矫味剂蔗糖的考察 以10%明胶作为基础，加入不同比例的蔗糖，配制成蔗糖浓度为1%、2%、3%、4%、5%（w/V）的明胶-蔗糖基质。按、“2.2.2”、“2.2.3”、“2.2.4”项下方法进行感观评价、持水性、粘弹性试验。持水性、粘弹性结果分别见图3、图4。

结果显示，当配比为10%明胶-3%蔗糖时，基质光滑透明、色泽悦目、口感适宜，且具有良好的持水性以及粘弹性。

2.2.6 优化处方组成及制备工艺 处方组成为枸橼酸西地那非1%、2%、3%，泊洛沙姆F127 5%，明胶10%，蔗糖3%。其制备工艺：称取泊洛沙姆F127 适量溶于，蒸馏水中配制成5%溶液，加入适量的枸橼酸西地那非，室温下搅拌溶解。再加入处方量明胶、蔗糖，在水浴70 ℃下搅拌溶解。待溶解完全后，水浴搅拌下降至37 ℃，放置于冰箱4 ℃冷却至半固态。

2.3 含量测定

2.3.1 样品制备 按“2.2.6”项下确定的处方及工艺，制备浓度为1、2、3 mg·mL-1的3 种规格的枸橼酸西地那非凝胶剂。

2.3.2 含量测定 分别从浓度为1、2、3 mg·mL-1的3 种凝胶剂中精密称取1 g 凝胶，切成大小均匀的细块，置于50 mL 量瓶中，加入适量流动相溶解，超声至凝胶完全溶解后，以流动相稀释至刻度。按“2.1.3”项下色谱条件进样分析，记录峰面积。按外标一点法计算半固体凝胶中的药物含量，每个样品平行制备3 份。结果显示，在1～3 mg·mL-1范围内，药物回收与投药量存在线性关系，Y=0.823X+0.053（r2=0.998 9），可设定为枸橼酸西地那非凝胶剂的药物含量。

2.4 凝胶剂溶出度试验

2.4.1 样品制备 分别从浓度1、2、3 mg·mL-1的3种枸橼酸西地那非凝胶剂中精密称取10 g 凝胶，将其切割成大小均匀的小块备用。

2.4.2 溶出度试验 按照《中国药典》（2015 版）溶出度测定第二法（桨法）[11]，以0.1 mol·L-1盐酸溶液900 mL 为溶出介质（37 ℃±0.5 ℃），转速设定为50 r·min-1。将制备好的样品投入溶出杯内，开始计时，然后按间隔5、10、15、30、45、60、120 min 定时取样。每次取样5 mL，用0.45 μm 聚醚砜滤膜过滤，取续滤液，按“2.1.3”项下色谱条件进样分析，记录峰面积，按公式（3）计算枸橼酸西地那非凝胶剂的累积溶出度。每个样品平行制备3 份；结果见图6。

枸橼酸西地那非凝胶剂在5 min 时药物溶出度已经超过90%，在2 h 内药物溶出度维持在95%左右，能够充分释放药物，有利于患者吸收。

式中：A对为枸橼酸西地那非对照品溶液的峰面积；A0为枸橼酸西地那非凝胶剂0 时刻溶液的峰面积（此时峰面积为0）；An为枸橼酸西地那非凝胶剂第n 个时间点溶液的峰面积（n≥1）；C对为枸橼酸西地那非对照品溶液浓度（mg·mL-1）；V1为补充溶出介质体积/mL（本实验中为5 mL）；V2为溶出介质体积/mL（本实验中为900 mL）；m理论为枸橼酸西地那非凝胶剂的理论含药量/mg。

3 讨论

果冻型凝胶剂是一种含药物的吞咽辅助型凝胶剂，具有改善药物吞咽、掩盖药物异味、饮用方便等优点[12]。有研究针对治疗老年人的骨质疏松症、制备了负载阿仑膦酸酯药物的口服凝胶，适用于吞咽困难的老年患者，提高其用药顺应性[13]。此类制剂在稳定性、剂量准确性、使用方便性、患者依从性等方面都具有很大的优势。

在凝胶剂制备过程中，最重要的成分是胶凝剂，本研究考察了明胶和卡拉胶，前者在持水性、均一性、粘弹性、透明度、口感等方面均良好。

枸橼酸西地那非在《中国药典》中并未收录，本研究参考了《美国药典》（USP 40），建立了体外溶出度测定法，并通过专属性、精密度、线性范围、稳定性等进行方法学验证，为枸橼酸西地拉非凝胶剂的含量及体外溶出测定提供了可靠、准确的分析方法。

临床上口服西地那非治疗PPNH 常用剂量为0.5～1 mg/次，每6 h 服用一次，可显著降低患儿肺动脉压力[1]。该凝胶剂处方中使用了增溶剂，对枸橼酸西地那非进行增溶，使其溶解度显著提高至3.5 mg·mL-1，所设计的载药量为1～3 mg·mL-1的凝胶剂能被完全溶解，并且增加载药量能够减少用药体积，提高新生儿的用药顺应性。通过考察，确定了载药量1～3 mg·mL-1为制剂设定的规格。

经体外溶出度试验，该凝胶剂在5 min 时药物累计溶出已经超过90%，说明在胃中能够快速且有效地释放，利于患儿吸收。

研制枸橼酸西地那非凝胶剂，有望达到吞咽时无异物感、改善药物疗效、提高患者依从性等目的，具有开发的潜力。