复方银花解毒颗粒的指纹图谱、多成分含量测定及多元统计分析

2022-01-14刘光大吴建雄王书源杨琳妹何枢衡

药学与临床研究 2021年6期

刘光大，吴建雄，王书源，黄雁，杨琳妹，何枢衡

合肥亿帆生物制药有限公司，合肥 230000

复方银花解毒颗粒是由10 味中药组成的复方制剂。该方来源于临床经验方“银花解毒汤”，方中山银花、连翘为君药。银花味甘性寒，气味芳香，连翘苦而微寒，轻清上浮，两药皆能解表透邪、清热解毒。臣药为荆芥、豆豉、薄荷，有疏散解表之功，共助君药开皮毛而散热。佐药青蒿芳香透邪；大青叶清热凉血；野菊花、鸭跖草清热解毒；前胡宣散风热，肃肺化痰。诸药合用，具有疏表透邪、轻宣肺气的作用，适用于普通感冒、流行性感冒的风热症候。

复方银花解毒颗粒现行药品标准收载于《新药转正标准》第75 册，除薄层鉴别外，主要通过HPLC法对制剂中绿原酸含量进行定量分析，为便于全面控制药品质量，宜建立更加有效的质量评价方法。

中药指纹图谱结合多个有效组分含量测定是控制中药质量的有效方法[1]。聚类分析（CA）、主成分分析（PCA）、正交偏最小二乘法-判别分析（OPLSDA）等化学计量学分析方法，可以充分整合指纹图谱提供的多维信息，有利于揭示中药复方制剂复杂成分间隐藏的规律[2]。本研究采用HPLC 法建立了复方银花解毒颗粒的指纹图谱，标定了来源于山银花、连翘、青蒿、大青叶、野菊花等5 味药材中的15个共有指纹峰；采用相似度评价结合上述化学计量学识别方法对指纹图谱数据进行分析；同时对鉴别出的8 个化学成分进行含量测定，从定性与定量两个方面对复方银花解毒颗粒的质量进行评价。

1 材料

1.1 仪器

Ultimate 3000 型高效液相色谱仪（美国赛默飞世尔科技公司）；ME204E/MS105DU 型电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-500DE 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 药品及试剂

对照品：绿原酸（批号110753-201817，纯度96.8%）、连翘酯苷A（批号111810-201707，纯度97.2%）、连翘苷（批号110821-201816，纯度95.1%）、蒙花苷（批号111528-201911，纯度98.5%）均购于中国食品药品检定研究院；新绿原酸（批号4974，纯度98.0%）、隐绿原酸（批号3208，纯度98.3%）、异绿原酸B（批号3089，纯度99.7%）、异绿原酸A（批号7692，纯度98.7%）、4，5-二-O-咖啡酰奎宁酸（批号3001，纯度99.2%）均购于上海诗丹德标准技术有限公司。

供试品：复方银花解毒颗粒（批号：190301、1903008、1903009、190312、190313、190315、190401、190402、190407、190408、180903、180906、180910、180911、180917，分别编号为S1-S15）由天长亿帆制药有限公司生产；山银花、连翘、荆芥、淡豆豉、薄荷、青蒿、大青叶、野菊花、前胡、鸭跖草均购自芍花堂国药股份有限公司。

乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Kromasil 100-5-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脱（0～10 min，5%～10%A；10～25 min，10%～13%A；25～50 min，13%～20% A；50～60 min，20%～32% A；60～65 min，32%～42%A）；指纹图谱检测波长230 nm，含量测定检测波长330 nm；柱温：30 ℃；体积流量：1.0 mL·min-1；进样量：10 μL。理论板数按绿原酸峰计算应不低于5000。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液分别精密称取对照品新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、连翘酯苷A、异绿原酸B、异绿原酸A、4，5-二-O-咖啡酰奎宁酸、连翘苷、蒙花苷适量，置于100 mL 量瓶中，50%甲醇定容至刻度，即得（质量浓度分别为20.6、50.7、21.6、48.3、20.2、41.0、32.2、21.0、20.1 μg·mL-1）。

2.2.2 供试品溶液取本品适量，研细，称取约0.3 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，称定重量，超声处理30 min（400 W，40 kHz），放至室温，称定重量，用50%甲醇补足失重，过滤，取续滤液，即得。

2.2.3 单味药材颗粒样品溶液按本品现行的药品标准中的制法，将处方中各味药材分别制备成单味药材颗粒，并按“2.2.2”项下方法制备单味药材颗粒样品溶液。

2.2.4 阴性颗粒样品溶液按本品现行的药品标准中的制法，分别制备缺山银花、连翘、野菊花、青蒿、大青叶5 味药材的阴性颗粒，并按“2.2.2”项下方法制备阴性颗粒样品溶液。

2.3 HPLC 指纹图谱研究

2.3.1 进样精密度试验取供试品（S15），按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件检测，连续进样6 次。测得15 个共有峰保留时间的RSD 值均＜0.5%，峰面积的RSD 值均＜2.0%，表明仪器精密度良好。

2.3.2 重复性试验取供试品（S15）适量，按“2.2.2”项下方法平行制备6 份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件检测。计算15 个共有峰保留时间和峰面积的RSD；计算各共有峰的峰面积RSD 时，以峰面积和取样量的比值代替峰面积进行计算。结果表明，各共有峰保留时间的RSD 值均＜0.5%，峰面积的RSD 值均＜3.0%，表明该方法重复性良好。

2.3.3 稳定性试验取供试品（S15），按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别在制备后的0、3、6、12、18、24 h，按“2.1”项下色谱条件检测。测得15 个共有峰保留时间的RSD 值均＜0.5%，峰面积的RSD值均＜2.0%，表明供试品溶液在24 h 内稳定。

2.3.4 对照指纹图谱的建立及相似度评价取供试品15 批（S1～S15），按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定。采用2012版“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”分析指纹图谱，选择S1 做为参照图谱，采用多点校正后进行Mark 峰匹配，生成对照指纹图谱，结果见图1。

将15 批供试品色谱图与对照指纹图谱进行相似度评价，S1～S15 相似度分别为0.991、0.990、0.990、0.990、0.995、0.990、0.976、0.976、0.976、0.976、0.976、0.977、0.981、0.982、0.962。15 批样品与对照指纹图谱的相似度均较高，表明不同批次样品的质量较为接近。

2.3.5 共有峰指认与归属按“2.2.1”、“2.2.2”、“2.2.3”、“2.2.4”项下方法制备对照品溶液、供试品溶液、单味药材颗粒样品溶液及阴性颗粒样品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析。通过保留时间和DAD 紫外吸收图谱对照分析，确定了各共有峰对应的化学成分和药材归属。混合对照品、供试品以及阴性颗粒样品的HPLC 色谱图见图2；供试品以及各单味药材颗粒样品的HPLC 色谱图见图3。各共有峰对应的化学成分和药材归属见表1。

表1 复方银花解毒颗粒共有峰归属

图2 复方银花解毒颗粒指纹图谱峰指认结果

图3 复方银花解毒颗粒共有峰归属

2.3.6 聚类分析（CA）采用SPSS 25.0 软件，以15批复方银花解毒颗粒样品中15 个共有峰的相对峰面积为变量，采用组间联接系统聚类法，以平方欧氏距离（squared euclidean distance）为测度，进行聚类分析，结果见图4。

当平方欧式距离为15 时，15 批供试品可聚为2 类：第Ⅰ类包括供试品S1～S10；第Ⅱ类包括供试品S11～S15。分析结果表明，不同批次复方银花解毒颗粒的指纹图谱存在一定差异，这可能与制剂所用药材的批间质量差异有关。

2.3.7 主成分分析（PCA）采用SIMCA 14.1 软件，以15 批复方银花解毒颗粒样品中15 个共有峰的峰面积为变量，进行主成分分析。分析结果表明，前2 个主成分的累计贡献率为93.6%，能够概括样品数据的绝大部分信息。因此，本研究以贡献率最大的2 个主成分为坐标轴，构建主成分平面，在损失少量信息的前提下，通过降维的方式将样品的多元变量投影在二维平面上，观察样品的整体分布情况及各变量对样品分布的贡献大小[3]，结果见图5、图6。由图5 得分散点图可知，15 批供试品数据均落在95%置信区间内，说明各批次样品化学成分基本一致，质量较为稳定；同时15 批供试品又可以分为2 类：第Ⅰ类包括样品S1～S10，第Ⅱ类包括样品S11～S15，与聚类分析结果较为一致。由图6 载荷图可知，15 个共有峰对样品分布情况的贡献不同，其中9 号峰、7 号峰、1 号峰、8 号峰、15 号峰、3 号峰、12 号峰、10 号峰距离中心点较远，表明对复方银花解毒颗粒样品分布的贡献率相对较大。

图5 15 批复方银花解毒颗粒PCA 得分散点图

2.3.8 正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA）在上述主成分分析的基础上，对分为2 类的15 批样品进行正交偏最小二乘法-判别分析，以筛选出对15 批样品贡献率较大的色谱峰，所得变量重要性投影值图（VIP 图）见图7。

VIP 图按照各成分对产品分类的影响大小进行各共有峰排序，成分的VIP 越大，对产品分类的贡献越大，当VIP 值＞1 时，表明该成分对产品质量的影响具有统计学意义，可以选做差异标志物[4]。结合图6 主成分分析载荷图和图7VIP 图，共筛选出5个差异标志物，根据VIP 值大小依次为：峰9（连翘酯苷A）、峰7、峰8、峰1、峰3（绿原酸）；结合共有峰归属结果可知，这5 个峰主要来自君药山银花和连翘两味药材。

图6 15 批复方银花解毒颗粒PCA 载荷图

图7 15 批复方银花解毒颗粒囊OPLS-DA 分析VIP 图

2.4 含量测定

在上述研究的基础上，对包括连翘酯苷A、绿原酸2 个差异标志物在内的8 个化学成分的含量进行定量分析。

2.4.1 溶液配制对照品溶液、供试品溶液及阴性颗粒样品溶液依次按“2.2.1”、“2.2.2”、“2.2.4”项下方法制备。

2.4.2 专属性考察按“2.2.1”、“2.2.2”、“2.2.4”项下方法制备对照品溶液、供试品溶液及阴性颗粒样品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样检测，结果见图8。由此可知阴性样品无干扰，本方法专属性良好。

图8 复方银花解毒颗粒含量测定色谱图

2.4.3 线性关系考察按“2.2.1”项下方法制备含新绿原酸71.5 μg·mL-1、绿原酸272.0 μg·mL-1、隐绿原酸60.5 μg·mL-1、连翘酯苷A 165.7 μg·mL-1、异绿原酸B 137.1 μg·mL-1、异绿原酸A 183.1 μg·mL-1、4，5-二-O-咖啡酰奎宁酸189.0 μg·mL-1、蒙花苷88.2 μg·mL-1的混合对照品储备液。取该储备液，用50%甲醇溶液倍比稀释，依次精密稀释为原浓度的1/2 倍、1/4 倍、1/8 倍、1/16 倍、1/32 倍、1/64 倍的浓度，得到系列质量浓度的混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件依次进样检测。以对照品浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归。8 个化学成分的回归方程见表2。

表2 8 个化学成分回归方程与线性范围

结果表明，进样体积为10 μL 时，8 个化学成分的质量浓度在一定的范围内与峰面积呈良好线性关系。

2.4.4 进样精密度试验取供试品（S15）适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件检测，连续进样6 次。测得新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、连翘酯苷A、异绿原酸B、异绿原酸A、4，5-二-O-咖啡酰奎宁酸、蒙花苷8 个成分的峰面积RSD 均＜0.5%，表明仪器精密度良好。

2.4.5 重复性试验取供试品（S15）适量，按“2.2.2”项下方法平行制备6 份供试品溶液，取“2.2.1”项下制备得到的对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件检测对照品和供试品溶液。测得8 个成分的含量RSD 均＜1.5%，表明该方法重复性良好。

2.4.6 稳定性试验取供试品（S15）适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别在制备后的0、3、6、12、18、24 h，按“2.1”项下色谱条件检测。测得8 个成分峰面积的RSD 值均＜0.5%，表明供试品溶液在24 h 内稳定。

2.4.7 准确度试验取供试品（S15）约0.15 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入“2.4.3”项下混合对照品储备液2 mL，其余操作步骤按“2.2.2”项下方法进行，制备供试品溶液，平行6 份；取“2.2.1”项下制备得到的混合对照品溶液；按“2.1”项下色谱条件检测对照品和供试品溶液。根据检测结果及对照品加入量，计算各成分的平均加样回收率和RSD 值，计算得到新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、连翘酯苷A、异绿原酸B、异绿原酸A、4，5-二-O-咖啡酰奎宁酸、蒙花苷的平均加样回收率分别为100.3%、102.7%、99.2%、97.6%、101.6%、101.0%、102.2%、100.5%，RSD 值分别为1.2%、1.1%、1.5%、1.1%、0.7%、1.2%、0.8%、1.3%，表明该方法的准确度良好。

2.4.8 样品测定分别取15 批供试品（S1～S15）适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液；取“2.2.1”项下制备得到的对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件检测对照品和供试品溶液。计算样品中8 个化学成分的含量，结果见表3。

表3 15 批复方银花解毒颗粒中8 种成分含量测定结果（n=3）

现行质量标准规定，每袋（15 g）颗粒含绿原酸不得低于30 mg，即每克颗粒含绿原酸不得低于2 mg；由实验结果可知，15 批供试品均符合现行标准规定，但是不同批次颗粒中各成分含量存在一定差异，这可能是该制剂所用药材的质量存在差异所致。

3 讨论

3.1 检测方法的优化

本研究采用DAD 检测器在190～400 nm 范围内对供试品溶液进行全波长扫描，结果发现，在230 nm处色谱峰信息较为丰富，且基线较为平稳，故选择230 nm 作为指纹图谱检测波长；新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、连翘酯苷A、异绿原酸B、异绿原酸A、4，5-二-O-咖啡酰奎宁酸、蒙花苷8 种化学成分的最大吸收波长均在330 nm 附近；并且在330 nm 波长下，各色谱峰分离度良好，8 个成分的色谱峰峰纯度匹配值均＞0.985，表明各色谱峰纯度较高，故选择330 nm 作为含量测定的检测波长。

本研究考察了不同提取方式（回流、超声）、不同提取溶剂（甲醇、50%甲醇、乙醇、50%乙醇、水）、不同提取时间（15、30、45 min）、不同流动相体系（乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液、甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.1%磷酸水溶液）、不同柱温（25 ℃、30 ℃、35 ℃）等因素[5-8]的影响。结果表明，样品采用50%甲醇25 mL 超声提取30 min，可以兼顾提取效率、色谱峰峰型以及基线平稳度；当流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液、柱温为30 ℃时，各色谱峰峰形和分离度较好。

3.2 指纹图谱及模式识别分析

指纹图谱结果显示，15 批供试品与对照指纹图谱的相似度均≥0.962，表明不同批次样品间相似度较高，整体质量较为稳定。聚类分析和主成分分析均将15 批样品分成2 类，这可能与不同批次制剂所用药材产地、采收期各异等因素有关。OPLS-DA分析结果显示，模型解释率参数R2Y=0.999，预测能力参数Q2=0.995，均高于0.5，且两者之差较小，说明模型拟合程度较好，具有较强的预测性和稳定性。设置分类Y 矩阵变量、随机排列200 次做置换检验，R2拟合直线在Y 坐标轴的截距为0.184，低于模型解释率R2Y（0.999），且＜0.3，说明所建模型可靠；得Q2拟合直线截距为0.757，低于模型预测度Q2，且＜0.05，说明所建模型可靠，不存在过度拟合现象[9]。PCA 和OPLS-DA 分析结果显示，主要来源于君药山银花、连翘两味药材的峰9（连翘酯苷A）、峰7、峰8、峰1、峰3（绿原酸）对不同批次制剂的分类影响较大。为了提高产品的均一性和稳定性，后续应进一步加强对山银花、连翘这两味药材的质量控制来减少批间质量差异；同时在生产过程中对这些差异标志物建立质量控制体系。

3.3 定量指标的选择

本研究通过对照品对照指认出新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、连翘酯苷A、异绿原酸B、异绿原酸A、4，5-二-O-咖啡酰奎宁酸、蒙花苷8 个成分。山银花、连翘均具有清热解毒、疏散风热的功效[10]，其中绿原酸类多酚成分是山银花中抗菌、抗病毒的主要有效成分[11]；连翘酯苷A 作为连翘的主要指标成分之一，具有显著的抗炎、抗菌、抗病毒作用[12，13]。结合PCA和OPLS-DA 分析结果，选择与制剂功效相关，且包含了连翘酯苷A 和绿原酸2 个差异标志物的8 个化学成分进行定量分析。