HPLC法测定尪痹颗粒中桂皮醛、淫羊藿苷和柚皮苷成分的含量

蒋 菲，刘业飞，程庆兵，郑 正，王 玮（合肥市食品药品检验中心质保科，安徽 合肥 230061）

尪痹颗粒具有补肝肾、强筋骨、祛风湿、通经络等功效，临床上常用于治疗肝肾不足、风湿阻络所致的尪痹等病症，在治疗类风湿性关节炎方面效果较佳[1]；该产品由地黄、熟地黄、续断、附片（黑顺片）、骨碎补、桂枝、淫羊藿等17味药材加工制成。2020年版《中华人民共和国药典》（简称《中国药典》）标准中规定含量测定项针对淫羊藿药材中的淫羊藿苷进行[2-3]。桂枝有发汗解肌、温通经脉、助阳化气、平冲降气等功效[4-7]，淫羊藿有补肾阳、强筋骨、祛风湿等功效[8-11]，骨碎补有疗伤止痛、补肾强骨等功效[12-15]；该药在风湿性关节炎等疾病的应用也日益增多[16-19]。现行国家标准中仅针对淫羊藿药材中淫羊藿苷的测定不能全面体现该产品的质量水平，为保障患者的用药安全，提高现有标准中质量控制手段，现针对尪痹颗粒中的君药骨碎补、臣药淫羊藿和佐药桂枝，研究同时测定桂皮醛、淫羊藿苷和柚皮苷含量的HPLC方法，为该药的质量控制提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

采用SHIMADZU LC-20AD型高效液相色谱仪系统（配备DGU-20A型在线脱气机、LC-20A型四元泵、SPD-M20A型二极管阵列检测器，日本岛津仪器公司）；赛多利斯CPA 225D型电子天平（精度：十万分之一，德国赛多利斯仪器公司）；Waters Symmetry C18液相色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 µm，美国沃特世仪器公司）；Milli-Q Direct 8型纯水系统（美国默克密理博仪器公司）；KQ-5200DE型数控超声波清洗器（昆山超声仪器公司）。

1.2 药品与试剂

尪痹颗粒样品[辽宁好护士药业（集团）有限责任公司，规格：6 g，批号分别为：190312、190925、200109]；实验用乙腈、甲醇、浓磷酸：分析纯，均购自上海化学试剂厂；实验用水：纯化水，由纯水系统制备。对照品：桂皮醛，批号：110710-201821，含量以99.6%计；淫羊藿苷，批号：110737-201516，含量以94.2%计；柚皮苷，批号：110722-201815，含量以91.7%计，均购自中国食品药品检定研究院。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Waters Symmetry C18液相色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 µm），流动相：0.5%磷酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（见表1）；检测波长282 nm；流速1.0 mL·min-1；柱温25 ℃；进样量10 µL。

表1 梯度洗脱程序Tab 1 Gradient elution procedure

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品储备溶液分别精密称取柚皮苷、淫羊藿苷和桂皮醛对照品适量，置25 mL棕色容量瓶中，加甲醇超声处理5 min（功率300 W，频率40 kHz）使溶解，制成质量浓度分别为550、942、996 µg·mL-1的对照品储备溶液。

2.2.2 对照品混合溶液取“2.2.1”项对照品储备溶液，分别精密量取5.0 mL，置50 mL棕色容量瓶中，加甲醇定容至刻度，即得。

2.2.3 供试品溶液取尪痹颗粒样品适量，研细混匀，取1.0 g精密称定，置25 mL棕色容量瓶中，加甲醇20 mL，超声处理25 min（功率300 W，频率40 kHz），取出放冷，加甲醇定容至刻度，摇匀，采用0.45 µm滤膜过滤，取续滤液，作为供试品溶液。

2.2.4 阴性对照溶液按尪痹颗粒药材比例和加工工艺分别制备缺骨碎补、缺淫羊藿和缺桂枝的阴性样品，阴性样品按“2.2.3”项供试品溶液处理，制备阴性对照溶液。

2.3 专属性考察

取“2.2”项下对照品混合溶液、供试品溶液、阴性对照溶液和空白溶液，分别按“2.1”项下色谱条件进样10 µL，记录色谱图。结果显示柚皮苷、淫羊藿苷和桂皮醛与相邻峰之间分离度均> 1.5，3种成分色谱峰理论塔板数均> 3000，且对照品溶液与供试品溶液中3种成分色谱峰保留时间一致，阴性对照溶液无干扰峰存在。见图1。

图1 HPLC色谱图A - 对照品混合溶液，B - 供试品溶液，C - 骨碎补阴性对照溶液，D - 淫羊藿阴性对照溶液，E - 桂枝阴性对照溶液，F - 空白溶液；1 - 柚皮苷，2 - 淫羊藿苷，3 - 桂皮醛Fig 1 HPLC chromatogramA - mixed solution of reference substance, B - sample solution, C -rhizoma drynariae negative reference solution, D - epimedium negative reference solution, E - ramulus cinnamomi negative reference solution,F - blank solution; 1 - naringin, 2 - icariin, 3 - cinnamaldehyde

2.4 线性关系考察

取“2.2.1”项下对照品储备溶液，分别精密量取0.01、0.05、0.10、0.50、1.00 mL，置10 mL棕色容量瓶中，加甲醇制备含柚皮苷、淫羊藿苷和桂皮醛系列标准曲线溶液，分别按“2.1”项下色谱条件进样10 µL，记录色谱图。以峰面积（Y）为纵坐标，质量浓度（X）为横坐标进行线性回归，计算标准曲线方程。详见表2。

表2 回归方程和线性范围Tab 2 Regression equations and linear ranges

2.5 仪器精密度试验

取“2.2.2”项下对照品混合溶液，按色谱条件进样10 µL，连续进样6次，记录峰面积。结果显示柚皮苷、淫羊藿苷、桂皮醛峰面积RSD分别为1.25%、1.08%、0.96%，表明仪器精密度良好。

2.6 样品稳定性试验

取尪痹颗粒（批号：190312）样品，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，分别于室温下放置0、2、4、8、12、24 h，按色谱条件分别进样10 µL，记录峰面积。结果显示柚皮苷、淫羊藿苷和桂皮醛峰面积RSD分别为1.87%、2.06%、1.42%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.7 方法重复性试验

取同一批尪痹颗粒（批号：190312）样品，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，平行制备6份，按色谱条件分别进样10 µL，记录峰面积，计算3种成分的含量。结果显示柚皮苷、淫羊藿苷、桂皮醛的RSD分别为2.69%、2.51%、1.93%，表明本方法重复性良好。

2.8 加样回收考察试验

取已知含量的尪痹颗粒（批号：190312）样品，研细混匀，取1.0 g精密称定，置25 mL棕色容量瓶中，平行称取6份，分别精密加入柚皮苷、淫羊藿苷和桂皮醛标准溶液2.5 mL，按“2.2.3”项下方法制得6份加样回收溶液，按色谱条件分别进样10 µL，记录峰面积。根据检测量和加入量计算加样回收率。结果显示柚皮苷、淫羊藿苷、桂皮醛的平均加样回收率分别为100.49%、101.07%、99.10%，三种成分的RSD分别为2.06%、1.40%、1.83%（n= 6）。

2.9 市售样品检测

取3个批次的尪痹颗粒样品，分别按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按色谱条件分别进样10 µL，记录峰面积，计算3份供试品中3种成分的含量；同时，分别采用2020版《中国药典》中骨碎补和桂枝2种药材方法测定柚皮苷和桂皮醛含量，采用2020版《中国药典》中尪痹颗粒中成药个论方法测定淫羊藿苷含量，分别比较检测结果。结果表明，采用国家药典方法检测结果与本实验检测结果一致，见表3。但采用此方法缩短了分析时间，提高了工作效率，且能更全面的体现该产品的质量水平。

表3 含量检测结果. mg·g-1Tab 3 Results of content test. mg·g-1

3 讨论

3.1 检测波长的优化

取柚皮苷对照品，加甲醇制备1 mL溶液中含柚皮苷质量浓度为10 μg·mL-1的波长测试溶液，以同法制备淫羊藿苷、桂皮醛质量浓度为10 μg·mL-1的波长测试溶液；按“2.1”项下色谱条件，设置二极管阵列检测器波长扫描范围为200 ～ 400 nm，上述溶液分别进样10 µL，记录色谱图和光谱图。由3种成分光谱图可以看出，柚皮苷、淫羊藿苷、桂皮醛分别在284、271、289 nm处有最大吸收，3种成分最大吸收接近，结合色谱图响应，最终确定282 nm作为检测波长。

3.2 流动相的选择

中药成分检测常用的流动相体系为甲醇体系和乙腈体系。因桂皮醛和淫羊藿苷极性较弱，选择甲醇体系时，洗脱时间久，分析检测效率低，因此实验选择乙腈体系。取“2.2”项下对照品混合溶液、供试品溶液、阴性对照溶液和空白溶液，按“2.1”项下色谱条件，分别选择乙腈-0.5%磷酸体系、乙腈-水体系作为流动相，考察2种乙腈体系对3种成分分离、定量等的影响。结果显示选择乙腈-水体系时，柚皮苷色谱峰峰型较差，定量结果准确性偏低；选择乙腈-0.5%磷酸体系时，3种成分分离效果、峰型均较好，定性、定量结果准确。

3.3 提取溶剂的选择

柚皮苷、淫羊藿苷和桂皮醛均易溶于甲醇，2020版《中国药典》中骨碎补和桂枝药材中的柚皮苷和桂皮醛采用甲醇提取，淫羊藿药材中的淫羊藿苷采用稀乙醇提取。其中柚皮苷、淫羊藿苷在甲醇中稳定，有研究表明桂皮醛在甲醇中有微弱分解[20]。取已知含量的尪痹颗粒（批号：190312）样品，研细混匀，取1.0 g精密称定，置25 mL棕色容量瓶中，以甲醇作为提取溶剂，按“2.2.3”项下方法处理，制备供试品溶液，于室温下分别放置0、6、12、24 h，每个时间点取样1次，按色谱条件分别进样分析。结果显示4次检测结果平均RSD为2.07%，表明甲醇超声提取检测桂皮醛方法是稳定可行的。

3.4 提取方法的优化

尪痹颗粒是由17味药材组成，基质中含有的药材种类多，较为复杂，前处理方法的优化，对于提高分析效率和检测结果准确性有重要影响。取“2.9”项下3批次尪痹颗粒供试品，按“2.2.3”项下方法，分别设定提取时间为15、20、25、30 min，结果显示提取时间设定在25 min以上时，待测物的提取量基本无变化；分别设定超声功率为250、280、300、320、350 W，结果显示设定提取功率为300 W以上时，待测物的提取量基本无变化，故实验提取方法设定超声功率为300 W，时间为25 min。

综上，本实验针对尪痹颗粒分析了现行国家标准中含量测定项目存在的不足，建立了采用甲醇超声提取，HPLC法定量检测尪痹颗粒中的柚皮苷、淫羊藿苷和桂皮醛3种成分的分析方法。考察了方法的专属性、线性、稳定性等参数，结果显示与国家标准方法比较，此方法分析时间短、效率高，弥补了单一指标成分含量测定作为质量控制标准的不足，能够为全面监测该产品的质量水平及完善国家标准提供技术参考。