利拉鲁肽对KKAy小鼠脂代谢及PI3K蛋白表达的影响

吕 娟，陈莉娜，刘伟华，郭未艳（.西安市第一医院药剂科，陕西 西安 7000；.西安交通大学医学部基础医学院，陕西 西安7006；.西安市第一医院儿科，陕西 西安 7000）

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是胰岛素分泌和（或）作用缺陷所引起的一种慢性代谢性疾病[1]。中国是世界上糖尿病发病率上升最快的国家之一，目前我国糖尿病的发病率已高达10.9%[2]。肥胖和血脂代谢紊乱是糖尿病常见的并发症，也是多种疾病发病的重要危险因素[2-3]。因此，肥胖和血脂代谢紊乱防治对于延缓糖尿病进展及其并发症的发生具有重要意义。

利拉鲁肽是胰高血糖素样肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）类似物的一种，与人GLP-1具有97%的序列同源性[3]。文献[3-4]报道，GLP-1及其类似物除了具有降糖作用外，还具有减轻体重和改善血脂紊乱的作用，但其分子作用机制目前仍不明确。本研究以自发性糖尿病KKAy小鼠为动物模型，探讨利拉鲁肽对KKAy小鼠脂代谢及肝脏PI3K蛋白表达的影响，以期为探讨利拉鲁肽调节脂代谢的作用机制提供药理学基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级雄性KKAy小鼠12只，体重30 ～ 35 g；雄性C57BL/6J小鼠6只，体重20 ～ 25 g，两种小鼠均购自北京华阜康生物科技股份有限公司，动物合格证号：SCXK（京）2014-0004。KKAy小鼠给予高脂饲料，C57BL/6J小鼠给予普通小鼠维持饲料。所有小鼠均可自由进食、饮水；室温控制在20 ～ 25 ℃，相对湿度维持在45% ～ 55%。

1.2 主要试剂与仪器

利拉鲁肽注射液（丹麦诺和诺德公司，规格：3 mL∶18 mg，批号EP51548-1）；总胆固醇、甘油三脂试剂盒（南京建成生物工程研究所）；PI3K抗体（英国Abcam公司）；免疫组化试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）；罗氏卓越型血糖仪及血糖试纸（德国Roche Diagnostics GmbH有限公司）；Multiskan FC酶标仪（美国Thermo Fisher公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 分组及给药所有小鼠适应性喂养1周后，称量体重，剪尾采血测定随机血糖。KKAy小鼠随机血糖> 16.7 mmol·L-1认为模型成功。12只KKAy小鼠按体重、血糖随机分为利拉鲁肽组、模型组，每组6只，给予高脂饲料喂养；C57BL/6J小鼠6只作为对照组，给予普通饲料喂养。分组时小鼠体重和血糖情况见表1。利拉鲁肽组予利拉鲁肽注射液（250 μg·kg-1，ih），对照组和模型组小鼠皮下注射等量的生理盐水，各组小鼠每天给药1次，持续给药6周。末次给药后称重小鼠并放入代谢笼，测定进食及饮水量。实验结束后，称重小鼠，眼眶采血，离心（3000 r·min-1，10 min）取上清液，血清保存至-80 ℃冰箱备测。采血完毕后，分离肝脏，将所取肝脏组织称重后固定在10%甲醛溶液中保存备测。

1.3.2 指标检测①代谢笼实验：小鼠给药后称重放入代谢笼，给予定量的饲料和水，24 h后从代谢笼中取出小鼠，测定剩余饲料和水的量，计算小鼠24 h进食量及饮水量。②肝脏指数[5]：肝脏指数=肝脏重量/小鼠体重×100%。③总胆固醇（total cholesterol，TC）及甘油三酯（triglyceride，TG）检测：按照试剂盒说明书检测。④HE染色切片：从甲醛固定液中取出肝脏组织，石蜡包埋后常规切片，HE染色、封片，光镜下观察肝脏组织病理变化。⑤肝脏组织中PI3K的表达：肝脏组织石蜡包埋后切片，山羊血清封闭，一抗、二抗孵育，DAB显色，中型树胶封片，光镜下观察，拍照，对结果进行统计分析。

1.4 统计学方法

数据采用SPSS 17.0软件统计分析，计量资料以均值±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验，P< 0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 利拉鲁肽对KKAy小鼠进食、饮水量的影响

给药后，与对照组相比，模型组和利拉鲁肽组小鼠的进食及饮水量明显增加（P< 0.05）；与模型组相比，利拉鲁肽组小鼠的饮水量明显减少（P< 0.05），进食量虽有减少但差异无统计学意义（P> 0.05）。见表2。

2.2 利拉鲁肽对KKAy小鼠肝脏重量及肝脏指数的影响

给药后，与对照组相比，模型组和利拉鲁肽组小鼠的肝脏重量及肝脏指数显著增加（P< 0.05）；与模型组相比，利拉鲁肽组小鼠的肝脏重量及肝脏指数明显下降，差异均具有统计学意义（P< 0.05）。结果表明利拉鲁肽可减少KKAy小鼠肝脏脂肪沉积。见表3。

2.3 利拉鲁肽对KKAy小鼠血清中TC及TG的影响

给药后，与对照组相比，模型组和利拉鲁肽组小鼠的血清TC和TG含量显著增加（P< 0.05）；与模型组相比，利拉鲁肽组TC和TG含量虽有下降趋势但差异无统计学意义（P> 0.05）。见表4。

2.4 利拉鲁肽对KKAy小鼠肝脏组织形态的影响

HE结果显示，与对照组相比，模型组肝细胞肿胀、空泡样变（主要为脂肪变性），以小叶周边部最明显。与模型组相比，利拉鲁肽组肝细胞肿胀程度减轻，空泡样变减少，细胞核增多，炎症减轻。结果表明，利拉鲁肽可以减轻KKAy小鼠肝脏损伤。

2.5 利拉鲁肽对KKAy小鼠肝脏PI3K蛋白表达的影响

免疫组化结果显示，与对照组相比，模型组和利拉鲁肽组小鼠肝脏PI3K蛋白表达明显降低，差异具有统计学意义（P< 0.05）；与模型组相比，利拉鲁肽组PI3K蛋白表达显著增加（P< 0.05）。结果表明利拉鲁肽可提高KKAy小鼠肝脏组织PI3K蛋白的表达。见表5。

表5 利拉鲁肽对KKAy小鼠肝脏PI3K蛋白表达的影响. n = 6Tab 5 Effects of liraglutide on the expression of PI3K protein in liver tissue of KKAy mice. n = 6

3 讨论

利拉鲁肽注射液于2009年在欧盟首次上市，以浓度依赖形式促进胰岛素分泌，并可通过调节机体分泌胃泌素及胰高血糖素来发挥降糖作用[4,6]。有研究[7]表明，GLP-1可通过增加饱腹感和减少饥饿感来减少能量摄入，从而达到减重的目的。本课题组前期研究发现，利拉鲁肽可减轻KKAy小鼠体重，改善其胰岛素抵抗状态[8]。在本研究中，研究者运用代谢笼实验验证了利拉鲁肽对KKAy小鼠进食及饮水情况的影响，结果提示利拉鲁肽可减少KKAy小鼠的进食及饮水量。

肝脏是糖脂代谢的重要器官，脂代谢紊乱可导致脂肪在肝细胞内异常沉积从而诱发肝脏损伤[9-10]。肝脏重量和肝脏指数是衡量脂肪在肝脏沉积的重要指标[11]。本研究结果显示，KKAy小鼠的肝脏重量与肝脏指数较对照组明显增加，但经过利拉鲁肽干预后，KKAy小鼠的肝脏重量和肝脏指数显著下降。肝脏组织病理形态学结果显示，干预后小鼠肝脏细胞肿胀和脂肪变性有所减轻。结果证实利拉鲁肽可减少脂肪在肝脏的沉积，减轻肝脏损伤。

TC和TG含量异常变化是脂代谢紊乱的重要标志，也是多种心脑血管疾病的危险因素[12]。在胰岛素抵抗状态下，外周组织对葡萄糖的利用能力下降，脂肪分解加速产生大量的游离脂肪酸，过量的游离脂肪酸经循环系统进入肝脏合成胆固醇和甘油三酯[13]。本研究结果显示，KKAy小鼠血清TC和TG水平明显升高，证明存在脂代谢紊乱，使用利拉鲁肽干预后，KKAy小鼠血清TC和TG水平虽有下降趋势但差异无统计学意义。提示利拉鲁肽可在一定程度上缓解糖尿病脂代谢紊乱。

PI3K家族属于原癌基因，由Ⅰ类、Ⅱ类和Ⅲ类PI3K三个家族成员组成，其中主要起作用的是Ⅰ类PI3K，它是由一个p110（110 kd）催化亚基和一个p85（85 kd）调节亚基组成的异源二聚体，具有脂类激酶活性和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性，磷酸化后的PI3K可激活其下游的eNOS、GSK、GLUT4等多种底物受体，产生生物学效应[14-17]。有研究指出脂代谢紊乱和PI3K蛋白表达异常有着密切的关系[18]。本研究中，模型组KKAy小鼠肝脏组织PI3K蛋白的表达较对照组小鼠明显减少，经过利拉鲁肽干预后，肝脏组织PI3K蛋白表达量显著增加，表明利拉鲁肽可通过上调PI3K蛋白的表达来调节KKAy小鼠脂代谢紊乱状况。

综上，利拉鲁肽可在一定程度上降低KKAy小鼠进食量、TC及TG水平；显著减少KKAy小鼠饮水量；上调肝脏PI3K蛋白的表达；改善KKAy小鼠肝脏损伤状况。结果表明，利拉鲁肽可以改善脂代谢紊乱状况，其机制可能与肝脏组织PI3K蛋白的表达增加有关，但更明确的作用机制仍需要深入研究来探讨，为利拉鲁肽在糖尿病伴发脂代谢紊乱的临床应用提供药理学依据。