高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法测定谷类食品中的4种硒形态

孟 莉， 许亚丽， 夏曾润， 贺 博， 祁 蒙， 杜小平， 卜贤盼， 唐德剑*

(1.安康市富硒产品研发中心，陕西安康 725000；2.农业农村部富硒产品开发与质量控制重点实验室，陕西安康 725000)

随着人们生活水平的不断提高，科学补硒日益受到人们的重视。陕西省安康市地处秦巴山区腹地，是国内典型的天然富硒区，被誉为“中国硒谷”，其境内的天然富硒食品是人体获取硒的主要途径。目前，富硒大米、富硒小麦、富硒玉米等富硒谷类食品日渐成为人们研究和关注的热点。现有的我国的食品安全国家标准(GB 5009.93-2017)《食品中硒的测定》只能测定硒元素总量，而无法对硒的不同存在形态进行定性和定量分析。因此，建立准确、快速分析谷类食品中硒存在形态的检测方法，对于甄别富硒农产品和科学评价人群硒摄入量具有重要的实际意义。

目前，文献报道的测定硒形态的方法有液相色谱-原子荧光光谱法[1，2]、高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法[3 - 6]、离子色谱-积分脉冲安培检测法[7]、气相色谱-串联质谱法[8]、高效液相色谱-紫外检测法[9]及其他联用技术[10,11]。其中，高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱(HPLC-ICP-MS)联用技术是目前最常见的硒形态分析手段，该方法具有分离效率高、灵敏度高、线性范围宽、分析速度快等优点。本实验采用高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用技术测定谷类食品中SeCys2、Se(Ⅳ)、SeMet、Se(Ⅵ) 4种硒形态，考察了分析方法的准确性，为客观评价谷类食品的质量提供了科学依据。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

1260型高效液相色谱仪和7900型电感耦合等离子体质谱仪(美国，安捷伦公司)；电子分析天平(奥豪斯仪器有限公司)；雷磁pH计(上海仪电科学仪器股份有限公司)；Kertone Lab MINI系列实验室超纯水机(湖南科尔顿水务有限公司)。

蛋白酶ⅩⅣ(上海源叶生物科技有限公司)；SeCys2(GBW10087)、Se(Ⅳ)(GBW10032)、SeMet(GBW10034)和Se(Ⅵ)(GBW10033)标准溶液质量浓度(以Se计)分别为44.2、42.9、39.4、41.5 μg/g，均购于中国计量科学研究院；(NH4)2HPO4(分析纯，天津市天力化学试剂有限公司)；甲酸(分析纯，天津市天力化学试剂有限公司)；甲醇(色谱纯，国药集团化学试剂有限公司)。实验用水为超纯水。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的配制分别吸取一定量的SeCys2、Se(Ⅳ)、SeMet、Se(Ⅵ)标准溶液，用超纯水稀释，配制成1 mg/L(以Se计)的单标准储备溶液，4 ℃冰箱中保存。临用前取1 mg/L的SeCys2、Se(Ⅳ)、SeMet、Se(Ⅵ)储备溶液各2 g，用超纯水定容至10 g，得到200 μg/L的混合标准溶液。再将200 μg/L的混合标准溶液稀释，得到一系列混合标准溶液，质量浓度分别为1、5、10、50、100 μg/L。

1.2.2 样品前处理谷类食品试样，如富硒小麦、富硒玉米等均产自陕西省安康市。将试样烘干、粉碎，过40目筛，取0.2 g(精确至0.001 g)放入离心管中，加入20 mg蛋白酶ⅩⅣ和5 mL超纯水，涡旋30 s，37 ℃ 水浴超声3 h，期间振摇数次。静置10 min，4 ℃下以9 000 r/min离心10 min，取上清液过0.22 μm滤膜，待测。上机前存储于4 ℃冰箱中，在5 h之内完成测定[12]。同时做空白试验。

1.2.3 仪器条件HPLC条件：Hamilton PRP-X100阴离子交换柱(250 mm×4.1 mm,10 μm；美国哈密尔顿公司)，柱温为室温，流动相为40 mmol/L (NH4)2HPO4(用10%甲酸调节pH=6.0)，流速：1.0 mL/min，进样体积：100 μL。

ICP-MS条件：RF射频功率1 550 W，RF匹配电压1.8 V，采样深度8 mm，雾化室温度2 ℃，等离子体气体流速15.0 L/min，载气流速0.65 L/min，高He碰撞模式，碰撞气流速：4.5 mL/min，蠕动泵转速：0.3 r/s，检测质量数：m/z=78(Se)，积分时间：0.5 s[12]。

2 结果与讨论

2.1 硒形态混合标准溶液的色谱图

用40 mmol/L(NH4)2HPO4(pH=6.0)溶液作为流动相，SeCys2、Se(Ⅳ)、SeMet、Se(Ⅵ) 4种标准物质依次流出，峰形尖锐，分离良好，出峰时间合适。浓度为10 μg/L的4种硒形态混合标准溶液的色谱图如图1所示。

图1 10 μg/L硒形态标准溶液色谱图

2.2 方法的线性范围、相关系数及检出限

分别配制1、5、10、50、100、200 μg/L的SeCys2、Se(Ⅳ)、SeMet、Se(Ⅵ)混合标准系列溶液，以各浓度色谱峰面积(y)与对应质量浓度(x)绘制标准曲线。方法的线性范围和线性相关系数见表1，可以看出，在1～200 μg/L范围内，各硒形态线性关系良好，相关系数r均≥0.9995。采用逐级稀释法，当待测物的信噪比(S/N)≥3时，此时浓度为该化合物的检出限。当取样量为0.2 g，定容体积为5 mL时，SeCys2、Se(Ⅳ)、SeMet、Se(Ⅵ) 的方法检出限分别为4.8 μg/kg、4.5 μg/kg、7.0 μg/kg和5.2 μg/kg。

表1 4种硒形态的线性范围和方法检出限

2.3 方法的加标回收率和精密度

由于实际样品中4种硒形态的含量差异较大，为考察方法的准确性，采用在小麦样品中分别添加低、中、高3种浓度水平的SeCys2、Se(Ⅳ)、SeMet、Se(Ⅵ) 4种硒形态标准溶液，每个样品制备6个平行样品，测定4种硒形态含量，计算回收率和相对标准偏差(RSD)，结果见表2。结果显示，在3个质量浓度水平下，SeCys2的加标回收率在33.6%～73.5%之间，回收率偏低，可能由于SeCys2不稳定，易分解[13]。Se(Ⅳ)、SeMet、Se(Ⅵ) 3种硒形态的加标回收率为89.7%～99.3%，RSD均≤5.5%，说明方法的重复性良好，精密度高。

表2 小麦样品的加标回收率(n=6)

2.4 实际样品测定

按照国家标准(GB 5009.93)中的氢化物发生原子荧光光谱法测定陕西安康的大米、黑豆、玉米等谷类食品的总硒含量，并通过蛋白酶ⅩⅣ水解提取，采用HPLC-ICP-MS联用技术对其进行硒形态分析，结果见表3，其中提取效率用SeCys2、Se(Ⅳ)、SeMet、Se(Ⅵ) 4种硒形态含量总和与总硒含量的比值表示。结果显示，在大米中检出了SeCys2、Se(Ⅳ)、SeMet 3种形态，提取效率为62.2%，硒形态以SeMer为主；玉米中除Se(Ⅳ)外，其他3种硒形态均检出，提取效率达到84.5%，SeMer为主要硒形态，占总硒含量的82.6%；在黑豆和藜麦中同时检出了4种硒形态，SeMer含量最高；小麦中硒形态以SeMer为主。从结果中可以看出，SeMet是谷类食品的主要硒形态。

表3 实际样品硒形态含量测定结果

3 结论

本文采用超声辅助酶法提取，结合高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用技术测定秦巴山区谷类食品中SeCys2、Se(Ⅳ)、SeMet和Se(Ⅵ) 4种硒形态。该方法操作简单、快速、高效，精密度高，回收率好。通过小麦、大米、玉米等样品中硒的形态分析，发现硒代蛋氨酸是谷类食品中硒的主要形态，表明该法适用于谷类食品中硒形态的测定，可为规范富硒农产品生产和富硒食品安全性评价提供科技支撑。