光敏剂溴化5,10,15,20-四(4-吡啶基，N-丙基胺)对神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y杀伤作用研究

郭 燕， 肖 勃， 陈 絮， 陆周霞， 万洪志， 肖 雁， 肖 竦*

(1.贵州医科大学基础医学院化学教研室，贵州贵阳 550025：2.贵州医科大学分子生物学重点实验室，贵州贵阳 550001)

神经母细胞瘤(Neuroblastoma，NB)是婴幼儿中最常见的颅外实体瘤，占儿童肿瘤的8%～10%[1,2]。研究表明，低、中风险神经母细胞瘤的患儿预后非常好，但高风险患者的预后较差，患者通过化疗、放疗、手术、骨髓清除和免疫疗法可进行治疗，但生存率仍然低于50%[3 - 5]。因此，开发微创、低毒、存活率高的新治疗策略迫在眉睫。

光动力疗法(Photodynamic Therapy，PDT)作为一种新兴的抗肿瘤治疗手段，具有无创、毒性低、预后好、副作用小等优点。光动力肿瘤治疗包含三种重要因素：光敏剂(Photosensitizer，PS)、光和氧。光敏剂被特定波长的光激发，光能转移与氧结合，产生具有毒性的自由基和活性氧(Reactive Oxygen Species ROS)，导致细胞凋亡或者坏死[6 - 8]。理想光敏剂的特点是：易溶于水，性质稳定；生物相容性高，能够与细胞内对氧化损伤高度敏感的部位结合；具有靶向性；光照下活性氧的量子产率高；可快速从体内排出；毒副作用低[9]。

卟啉化合物是一类生物体内的天然产物，血卟啉衍生物是现代光敏剂的起源，其对肿瘤细胞具有选择性[10]，在光动力治疗的应用中一直占据很重要的位置。肿瘤细胞线粒体内部和细胞核带负电荷[11]，易与带正电荷的物质结合。基于此，本文合成水溶性较好，表面带正电荷的卟啉衍生物溴化5，10，15，20-四(4-吡啶基，N-丙基胺)(TPPPA)，其光动力作用于SH-SY5Y细胞的杀伤效果明显。

1 实验方法

1.1 主要仪器与试剂

Epoch2超微量微孔分光光度计(美国，Biotek)；FV1000激光扫描共聚焦显微镜(日本，奥林巴斯公司)；FACSCelesta流式细胞仪(美国，BD)；UV-2600紫外-可见光分光光度计(日本，岛津公司)；Caryeclipse荧光光谱仪(美国,VRIAN)。420 nm激光器(长春镭仕光电科技光电有限公司)。

人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y购于ATCC。2′，7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)试剂盒购于日本Sigma公司；3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基四氮唑溴化物(MTT)及二甲基亚砜(DMSO)购于北京索莱宝公司；细胞培养材料购于北京NEST公司；凋亡试剂盒购于美国BD公司；单线态氧绿色荧光探针(SOSG)购于美国Invitrogen公司；三氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺(DMF)购于山东金昊化工公司；丙酮购于天津科密欧公司；乙腈购于山东紫翔化工公司。

1.2 TPPPA合成和表征

TPPPA的合成线路如下：

称取5,10,15,20-四(4-吡啶基)卟啉(H2TPyP)123 mg(0.2 mmol)和N-Boc-3-氨基丙基溴952 mg(4 mmoL)，加入20 mL超干DMF，氮气保护下120 ℃反应24 h。冷却至室温，将反应液缓慢滴入50 mL乙腈中，待沉淀完全后，减压抽滤，分别用三氯甲烷、丙酮洗涤沉淀。将沉淀溶于10 mL三氟乙酸(TFA)/二氯甲烷混合溶液(体积比1∶1)，常温反应12 h。蒸去溶剂，加水溶解，调节溶液pH至7.0，蒸去溶剂，再用5 mL水/乙腈混合溶液(体积比1∶1)重结晶，得到紫红色固体。固体产物53 mg，产率约为22%。

1H NMR(DMSO,400 MHz):δ:9.61(d,8H),9.27(s,8H),9.03(d,8H),5.01(t,8H),3.47(t,8H),2.56(m,8H)。

将制备的TPPPA配制成浓度为10 μmol/L的溶液，测定动态光散射(Dynamic Light Scattering,DLS)，紫外-可见吸收光谱和荧光光谱。加入2.5 μL的SOSG溶液混匀，420 nm激光照射检测单线态氧。

1.3 细胞形态学观察

6孔板培养SH-SY5Y细胞，加入1 mL浓度为10 μmol/L的TPPPA溶液共同孵育24 h，420 nm激光照射后，用倒置荧光显微镜观察。

1.4 细胞内活性氧检测

6孔板培养细胞，用浓度为10 μmol/L的TPPPA溶液孵育24 h，然后加入1 mL浓度为10 μmol/L DCFH-DA孵育20 min，420 nm激光照射细胞后，继续孵育30 min，用无血清的培养液洗涤细胞3次，对照组不加光敏剂。用倒置荧光显微镜采集荧光图像，用图像软件ImageJ进行分析。

1.5 细胞存活率检测

96孔板培养细胞，加入100 μL一定浓度的TPPPA溶液共同孵育24 h，对照组不加药物孵育，光照后继续孵育24 h，每孔加入MTT溶液20 μL(5 mg/mL)，37 ℃培养箱中孵育4 h，弃去上清液，加入150 μL DMSO，室温振荡5 min，用超微量微孔分光光度计，于490 nm波长处测量吸光度。计算细胞生存率：细胞生存率=实验组OD值/对照组OD值×100%。

1.6 细胞凋亡检测

实验分为空白对照组、激光照射组、TPPPA药物组和TPPPA-PDT组。6孔板培养细胞，加入1 mL浓度为10 μmol/L的TPPPA溶液孵育24 h，420 nm激光照射(50 mW/cm2,3 min)，继续避光孵育6 h，用凋亡试剂盒检测，流式细胞仪分析。

1.7 TPPPA在SH-SY5Y细胞内的分布

采用激光共聚焦专用培养皿(Φ15 mm玻璃皿)培养细胞，加入1 mL浓度为10 μmol/L的TPPPA溶液孵育24 h后，再加入DAPI溶液孵育30 min，磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤细胞5次，420 nm激光照射(50 mW/cm2，1 min)后，用激光共聚焦扫描显微镜采集荧光图像。

2 结果与讨论

2.1 理化性质检测

药物具备良好的水溶性有利于其在体液内转运，结合到作用部位，从而产生药物效应。一般来说，毛细血管内皮细胞间的孔隙直径约60～120 nm，亲水性药物的分散粒径大小，影响药物通过细胞膜的水性通道，进而影响药物的跨膜转运[12]。当H2TPyP接入丙基胺后，吡啶基的侧链增长，空间位阻增大，分子间的静电斥力使之在水中的溶解性得到改善。DLS结果如图1所示，25 ℃下，TPPPA和H2TPyP的溶液均表现为单峰分布，大小均一，水合动力学粒径分别为～50 nm，～120 nm。TPPPA分散粒径减小，更易于通过细胞膜，促使药物有效进入细胞。

图1 H2TPyP和TPPPA的动态光散射图

10 μmol/L TPPPA水溶液与H2TPyP的DMSO溶液的紫外-可见吸收光谱、荧光发射光谱比较，其强度明显增强(图2)，体现良好的光谱性质。TPPPA的紫外-可见吸收光谱包括两个特征吸收(图2A)：420 nm左右的Soret带,以及500～600 nm区间的弱吸收Q带。向长波方向各吸收峰相对强度逐渐减弱。424.5 nm出现最大吸收(2.36)。如图2B所示，425 nm波长激发下，在710 nm发射较强的明亮红色荧光，接近近红外区域，近红外光在组织或细胞中的穿透力有明显优势，利于在细胞及组织中进行观察。

图2 H2TPyP、TPPPA的紫外-可见吸收光谱图(A)和荧光光谱图(B)

2.2 单线态氧的生成

卟琳类光敏剂主要的毒性产物是单线态氧，光照条件下由于激发光、光敏剂和分子氧的相互作用，平衡被打破，光敏剂受激光照射后与分子氧结合生成单线态氧的能力，直接影响光动力疗法的效果。利用荧光探针SOSG 检测产生单线态氧的量，如图3。TPPPA在420 nm、30 mW/cm2光照激发下，产生的单线态氧产率随光照时间增加而上升，呈现时间依赖性。由于丙胺基的引入，整个化合物的电子云密度降低，由基态跃迁到激发态的能量降低，使跃迁更易发生，处于激发态的光敏剂发生能量转移易产生较多的单线态氧，如果作用于肿瘤细胞，会引起一系列生理变化和对肿瘤细胞的毒性杀伤。这一结果为药物TPPPA进入肿瘤细胞后的杀伤作用提供了基础。

图3 TPPPA的单线态氧检测

2.3 形态学观察

在倒置荧光显微镜白场下观察光动力作用下细胞的形态变化(图4)。对照组细胞呈梭形或多角形贴壁生长，有神经突样突起(图4A)。实验组光照1 min后出现细胞变圆，胞浆中充满颗粒，胞膜边缘不光滑(图4B)。光照2 min 后大部分细胞变圆，胞质中出现空泡(图4C)。光照3 min后可观察到细胞膜崩解(图4D)。由于丙胺基的引入使TPPPA带正电荷，增强了与肿瘤细胞的阴离子基团的相互作用，亲和性增加，光动力作用下细胞形态变化明显。

图4 倒置显微镜下SH-SY5Y细胞形态改变(200×)

2.4 SH-SY5Y细胞内活性氧的检测

肿瘤细胞对ROS非常敏感，ROS的存在是光动力作用杀伤肿瘤细胞的重要决定因素[13,14]，采用DCFH-DA荧光探针对其进行检测[15]。TPPPA与细胞孵育24 h，420 nm激光(功率为50 mW/cm2)照射，细胞内产生的ROS明显增加(图5)。对图5A进行荧光定量分析，如图5B所示，显示出光照3 min细胞内产生的ROS约为光照1 min时的两倍(P<0.01)。

图5 TPPPA作用于SH-SY5Y细胞后ROS的产生

2.5 光动力作用检测

MTT结果显示，TPPPA的暗毒性很低(图6A),420 nm激光的光毒性很小(图6B)，TPPPA浓度为10 μmol/L，光照强度、光照时间均与细胞存活率成负相关(图6C和6D)，光照(50 mW/cm2)3 min时的光动力作用最强，细胞存活率仅为17.33%。采用最优检测条件(50 mW/cm2，3 min)，利用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，肿瘤细胞SH-SY5Y的凋亡率达到46.32%(图7)。细胞凋亡的方式有很多种，其中ROS的增加会引发抗氧化能力增强，细胞氧化还原系统失衡，导致严重的细胞损伤[16]。线粒体是产生ROS的主要部位，大量的ROS引起线粒体相关的促凋亡蛋白释放，引起细胞凋亡[17]。

图6 SH-SY5Y细胞存活率

图7 流式细胞仪检测SH-SY5Y细胞的凋亡情况(50 mW/cm2，3 min)

2.6 TPPPA在SH-SY5Y细胞中的分布

4′,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI)在荧光显微镜下发出蓝色荧光，可以和DNA结合用于活细胞细胞核的染色[18]。TPPPA发出的红色荧光可以指示其在细胞中滞留的位置。激光照射细胞(50 mW/cm2，1 min)孵育10 min后，可观察到TPPPA广泛分散在细胞质和细胞核(图8A)，孵育30 min后，TPPPA主要集中于细胞核(图8B)。由于TPPPA被丙胺基官能团修饰后带正电荷，且细胞线粒体内部和细胞核DNA表面均存在负电荷，光动力作用过程中，光敏剂通过细胞膜进入细胞，随着时间推移，再向细胞核转移。这可能因为TPPPA在光动力作用过程中线粒体功能逐渐发生障碍，结合作用减弱,通过静电作用定位于细胞核[19]。

图8 激光扫描共聚焦显微镜观察TPPPA在SH-SY5Y细胞内的分布(标尺=10 μm)

3 结论

合成获得的卟啉衍生物TPPPA，由于引入了极性丙基胺基团，水溶性较好，光学性能优良。借助卟啉衍生物TPPPA发出的红色荧光可观察药物在细胞中的分布情况。TPPPA水溶液带正电荷，激光照射后与细胞内带负电荷的物质结合进入细胞，广泛分布于细胞内，随后集中于细胞核。此过程产生的ROS，有效杀伤SH-SY5Y细胞。实验结果表明TPPPA具备理想光敏剂的特征，这将为设计和筛选带正电荷的光敏剂提供依据。