循环肿瘤细胞在预测晚期食管癌免疫治疗效果中的应用

刘阳阳

新泰市人民医院肿瘤科 山东 泰安 271200

食管癌是世界上第七大恶性肿瘤，在我国是第四大癌症相关死亡原因[1]，由于缺乏典型症状，初诊时往往为晚期。食管鳞状细胞癌和食管腺癌对系统治疗具有固有的耐受性，一线治疗后反应有限[2]。靶向药物在食管癌中的应用非常有限，而且仅在靶向人类表皮生长因子受体2(human epidermalgrowth factor receptor-2,HER2)或血管内皮生长因子的食管腺癌中使用[3]，目前没有证据表明靶向治疗对食管鳞癌有明显的益处。虽然传统的治疗方法已经得到了改进，但是5年的总生存率仍然很低，仅为30%～40%[4]。迫切需要新的治疗方法来改善这种疾病的预后。免疫治疗是食管癌治疗中一个相对较新的领域。随着免疫治疗KEYNOTE-181、ATTRACTION-3 和 ESCORT 结果的发布，确立了免疫治疗在晚期食管癌一线及二线治疗的地位[5-8]。免疫治疗改善了晚期食管癌患者的预后，但是只有约20% 的患者会对免疫检查点抑制剂产生反应[5]，寻找可以准确预测免疫治疗反应的生物标志物具有重大的临床意义。

循环肿瘤细胞(circulating tumor cell，CTC)是从表达上皮组织特点的肿瘤细胞发生间质性变，突破基底膜侵入血管内在血液中循环的肿瘤细胞，已被用作监测前列腺癌、乳腺癌和结直肠癌放化疗治疗效果和预后，是一种有前途的生物标志物[9]。有研究报道，CTC用于预测肺癌免疫治疗效果提示预后[10]，但对于食管癌免疫治疗效果及预后有何种提示作用不得而知。本研究旨在探讨CTC检测在预测晚期食管癌免疫治疗效果及预后的应用价值。

1 材料与方法

1.1 一般资料 以新泰市肿瘤治疗中心2019年2月至2020年1月收治的48例接受免疫治疗的晚期食管癌患者为研究对象，分别在治疗前(CTC1)、治疗2个周期(CTC2)采集血标本。纳入标准：经病理科确诊；患者年龄≥18周岁，美国东部肿瘤协作组(eastern cooperative oncology group, ECOG)评分≤2；预期生存时间≥4个月；无手术指征，一线治疗方案为靶向或化学治疗后病情进展；根据RECIST标准有可测量的病灶；能合作观察不良事件和疗效；受试者无主要器官的功能障碍，无免疫相关疾病；血常规、肝、肾功能及心脏功能正常；签署书面知情同意书。排除标准：存在免疫药物过敏史；因患精神病或其它原因不能依从治疗程序。本实验经新泰市人民医院伦理委员会批准。

1.2 研究方法

1.2.1 CTC富集和计数 采用阴性富集联合荧光原位杂交进行检测。收集上肢正中静脉7.5 mL血液加入ACD抗凝管中， Cyttel®人外周血白细胞去除试剂盒(江苏莱尔生物医药科技有限公司)阴性富集CTC，后CF1固定，在2×柠檬酸钠盐(SSC)中37℃作用10 min，75%、85%、100%乙醇梯度脱水，每梯度2 min，然后加入CEP8荧光原位杂交探针(上海群己生物科技有限公司)，置入杂交仪通过变性、杂交后洗去未结合探针，加入Alexa Fluor 594标记抗人CD45抗体(南京拜恩特斯生物科技公司生产)室温孵育1 h，加入4、6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，上海九岭化工有限公司生产)染色观察。目前尚无国际标准化判定标准，本研究以CTC数目≥3个结果判定阳性。同时满足有细胞核，即DAPI阳性(蓝色)视为CTC阳性细胞，如图1。

图1 典型CTC阳性细胞图像

1.2.2 免疫治疗方法 免疫方案二线采用卡瑞利珠单抗200 mg Q 21d方案。免疫治疗前、用药2周期后进行2次CTC检测；同时每2周期完善影像学检查，计算患者免疫治疗前后CTC阳性率，并分析CTC数目变化与免疫治疗效果的关系。参照实体瘤疗效评价标准(response evaluation criteria in solid tumor，RECIST)1.1 疗效评价[11]：完全缓解(complete response，CR)，所有靶病灶消失，无新病灶出现，且肿瘤标志物正常，至少维持4周；部分缓解(partial response，PR)，靶病灶最大径之和减少≥30%，至少维持4周；疾病稳定(stable disease，SD)，靶病灶最大径之和缩小未达PR或增大未达疾病进展(progressive disease，PD)；PD，靶病灶最大径之和至少增加≥20%或出现新病灶。疾病控制率(disease control rate，DCR)是指肿瘤缩小到一定程度或病变稳定保持4周的病人的比例，包含CR、PR和SD病例。

2 结果

2.1 晚期食管患者临床特征基线CTC计数 本研究食管癌患者典型CTC图像见图1。CTC计数结果显示，晚期食管鳞癌Ⅳ期患者CTC阳性。

2.3 基线CTC与近期疗效、无进展生存及总生存的关系 近期疗效参照RECIST 1.1评价标准，疗效CR者0例，PR者7例，SD者20例，PD者21例，DCR(CR+PR+SD)共27例，占56.2%。在DCR组中CTC阳性表达率为70.4%，在PD患者中阳性表达率为66.7%。免疫治疗前CTC与治疗后近期疗效差异无统计学意义。见表2。

表2 CTC数目与食管癌患者免疫疗效的关系/例

48例患者免疫治疗前进行了CTC检测，CTC阳性组的中位无进展生存期(progression-free survival，PFS)为6.3个月，CTC阴性组的中位PFS为5.6个月，见图2。治疗前CTC阳性组的中位总生存期(overall survival，OS)为10.7个月(9.6～14.7月)，CTC阴性组的中位OS为12.6个月(11.7～17.5月)，见图3。

图2 基线CTC阳性组与阴性组PFS比较

图3 基线CTC阳性组与阴性组OS比较

Log-rank检验结果提示，CTC分组的PFS及OS分布的差异无统计学意义；Cox回归结果提示，CTC分组的PFS及OS分布的差异不具有统计学意义。

2.4 治疗后CTC与近期疗效、PFS和OS的相关性 免疫治疗后患者CTC数目比治疗前CTC上升22例、下降26例。治疗后CTC上升组DCR率为13.6%，治疗后CTC下降组DCR率为92.3%，两者差异有统计学意义(P﹤0.01)，见表3。CTC升高组的中位PFS为6.3个月；CTC降低组的中位PFS为8.6个月(图4)。CTC升高组的中位OS生存时间为10个月；CTC降低组的中位生存时间为15个月(图5)。Log-rank检验结果提示，CTC分组的生存时间分布的差异具有统计学意义(P<0.05)；Cox回归结果提示，CTC分组的生存时间分布的差异具有统计学意义(P<0.05)。CTC降低组预后更好。

表3 免疫治疗后CTC数目变化与疗效的关系

图4 治疗后CTC升高组与降低组PFS比较

图5 治疗后CTC升高组与降低组OS比较

3 讨论

食管癌的临床治疗主要包括手术、化疗、放疗、靶向治疗及其综合治疗。新辅助放化疗和靶向治疗的使用提高了总生存率。然而，由于临床诊断为食管癌时，约有一半的患者有远处转移，手术不再适用[12]。转移性食管癌预后较差，以往治疗以化疗为主，标准5-氟尿嘧啶和顺铂为基础的一线姑息治疗后的中位OS为7～10个月[4]。免疫检查点蛋白程序性死亡(PD)-1抑制剂已被证明可增强包括食管癌在内的几种癌症中T细胞的抗肿瘤活性[13]。ATTRACTION-3[7]试验及Keynote-181[8]分别证实nivolumab可能代表了一种新的标准二线治疗选择与pembrolizumab作为PD-L1和联合阳性分数(combined positive score，CPS)≥10的食管癌新的二线治疗标准。除此之外我国自主研发的卡瑞利珠单抗和特瑞普利单抗在食管癌治疗中也显示初良好的效果[14]。同时这些抗PD-1抗体显示出比化疗药物更有利的安全性。但是，接受免疫治疗的患者中有一部分可能会出现严重免疫反应，从而导致预后不良。另外目前CPS、肿瘤突变负荷(tumor mutation burden，TMB)表达这些晚期食管鳞癌患者的治疗反应的预测性生物标志物尚不能满足临床需要，并且无法及时发现耐药，指导优化治疗策略。迄今为止，一些生物标志物已被广泛用于食管癌诊断和预后，包括癌胚抗原(CEA)、癌抗原19-9(CA19-9)和癌抗原72-4(CA72-4)[16]。然而，这些生物标志物的阳性率不到40%，其敏感性和特异性适中[17]。在这方面，CTC成为监测治疗反应和实时提供进展信息的有希望的标志物[18]。本研究探讨了CTC在预测晚期食管癌患者免疫治疗反应和预后中的应用价值。

CTC是从原发性肿瘤中分离出来并通过血管系统传播的细胞。先前的研究表明，在许多情况下，CTC的扩散和迁移是建立远处转移的主要原因[10]。CTC在转移前就存在于体液中，它们可能被用作未来转移形成的预测指标[10]。本研究显示Ⅳ期多脏器转移晚期食管癌患者CTC阳性率高于单发转移食管癌患者(P<0.05)。同时本研究发现治疗前CTC并不能反映近期疗效及无进展生存和总生存，DCR组中基线CTC阳性表达率为70.4%，在PD患者中基线阳性表达率为66.7%。免疫治疗前CTC与治疗后近期疗效差异无统计学意义，P>0.05，Log-rank检验及Cox回归结果提示，CTC分组的PFS及OS分布的差异不具有统计学意义(P>0.05)。但是否与诊断后治疗相关还是其他因素还需进一步实验证实。相关研究发现晚期非小肺癌患者行CTC和cfDNA实时连续监测，为治疗后的反应和总生存率提供了有用的补充预测和预后信息[19]。

食管癌治疗过程中关于CTC监测的多项研究报道，在化疗或放化疗前后通过进行CTC计数是一种很有前途的预测性生物标记物[9]。免疫治疗的机制不同于其他治疗，而且在免疫治疗后的短期内肿瘤负荷增加或出现新的病灶已经得到证实。因此，传统的评价原则是否仍然适用于免疫治疗仍然需要进一步的证实。有研究显示免疫检查点阻断治疗后CTC水平可有效预测晚期胃癌预后不良[9]。多变量COX分析表明，两个周期免疫治疗后获得的CTC计数是第IV周期后中期评估结果与早期疾病进展相关的唯一独立因素。

本研究表明治疗后CTC变化可反映近期疗效、无进展生存及总生存。免疫治疗后CTC上升组DCR率13.6%，下降组DCR率为92.3%，两者差异有统计学意义(P<0.01)。CTC升高组的中位PFS为6.3个月，CTC降低组的中位PFS为8.6个月，差异有统计学意义(P<0.01)。CTC升高组的中位OS生存时间为10个月；CTC降低组的中位生存时间为15个月，差异有统计学意义(P<0.01)。因此，CTC在治疗后效果监测中的应用是非常有前景的，另外CTC检测是一种有效、无创的肿瘤检测系统，方便患者治疗后病情的密切监测[10]。同时本研究发现治疗前基线CTC状态无法预测患者治疗效果及提示预后。目前的研究建议治疗后2～3周期CTC计数[15]，以提供重要的预测信息，为制定个体化诊疗决策提供依据，避免度过度诊疗。

本研究结果提示治疗后CTC的变化对晚期食管癌免疫治疗的近期疗效、无进展生存及总生存具有一定的预测价值。但本实验纳入的样本数少，需要开展更大样本的实验证实。