GZAS20200701 分离毒株gp85 基因克隆与序列分析

马燕 温贵兰* 陈广 张喜懿 张小波 巩雪竹 韦秒粘 王兴明

（1，贵州大学动物科学学院 550025；2，贵州省动物疫病预防控制中心 550025）

禽白血病（Avian leukosis，AL）是由禽白血病/肉瘤病毒群的禽白血病病毒（Avian leukosis virus，ALV）引起的鸡良性或恶性肿瘤性疾病，自然条件下以淋巴白血病最为常见，其他如成红细胞白血病、成髓细胞白血病、髓细胞瘤等出现的频率很低。ALV 按照其囊膜糖蛋白抗原差异和病毒干扰试验等被分为A～K 等11 个亚群[1]。其中A～D 亚群的病毒属于外源性病毒，E 亚群为内源性病毒，不具有感染性，而J 亚群的致病性和感染力较强。ALV 有垂直传播和水平传播两种传播方式，可使鸡群感染，发生免疫抑制，使鸡的生长速度受到影响，亦或发生死亡。蛋鸡患感染后其产蛋性能受到严重影响，同时会继发感染其他的病毒病和细菌病，给养殖业带来巨大的经济损失[2]。20 世纪90 年代初，英国学者初次从肉鸡体内分离到一种新型的禽白血病病毒J 亚群，J 亚群对鸡群有很高的致病性，相对于其他亚群，其传染性最强，世界各地均有本病存在[3]。在20世纪90 年代末，我国第一次在肉鸡中发现了ALV-J，而后随着人类生活水平的提高和需求扩大，病毒的宿主范围也因此逐渐扩大，在一些商品化蛋鸡和地方品种鸡中都有分离到该病毒，在野鸟体内也发现过该病毒[4]。ALV-J 基因组主要含有gag、pol 和env 3 个基因，其中gag 和pol 基因都十分保守，而包括gp85 在内的env 基因则有很大的变异，很大原因是受env基因编码的表面囊膜蛋白gp85 干扰，gp85 是识别靶细胞膜上的特异性病毒受体，是禽白血病病毒抗原的主要成分，有高度可变性，其抗原性能决定病毒的亚群特异性[5]。高脚鸡是贵州省的特色地方品种，1982 年以“高脚鸡”命名载入《贵州省畜禽品种志》，2006 年载入《中国畜禽资源名录》，高脚鸡由于生态分布范围窄，生态环境脆弱，生长迟缓，产蛋量和繁殖率低，没有引起养殖户的高度重视，目前正面临消失。本研究通过PCR 技术、同源性分析和系统进化树分析等方法对高脚鸡的ALV-J-gp85 基因序列进行分析，为高脚鸡养殖场提供一定的防控和净化禽白血病的技术支撑和数据参考，使高脚鸡得到更好的保存与发展。

1 材料

1.1 试验样品

贵州省某养殖场26 只送检高脚鸡的血清样品。

1.2 主要试剂

RNA 提取试剂盒，购自世纪元亨公司；2×Es Taq DNA 聚合酶，购自康为世纪有限公司；反转录试剂盒、DL 2000 DNA Marker，均购自宝生物工程(大连) 有限公司。

1.3 引物设计

参考文献合成ALV-A、ALV-B 和ALV-J[6]三重PCR 引物，根据GenBank 公布的ALV-J 原型毒株HPRS103 基因序列（GenBank 登录号：Z36973)，采用Primer Premier 5.0 软件设计了一对J 亚型禽白血病病毒gp85 特异性检测引物。引物序列如表1 所示。

表1 引物序列信息

2 方法

2.1 ALV p27 抗原ELISA 检测

使用北京维德维康生物技术有限公司的禽白血病病毒抗原检测试剂盒（ALV Antigen Test Kit）对采集的26 份高脚鸡血样进行检测。计算公式如下：

2.2 RNA 提取与反转录

根据说明书在无菌、干净的条件下提取样品中的病毒总RNA，然后置于-70℃进行保存，备用。以提取的总RNA 为模板进行反转录，反转录体系如表2。

表2 反转录体系

42℃孵育40min，85℃孵育5min，然后置于-70℃保存备用。

2.3 ALV-A/B/J 亚型RT-PCR 扩增

反应体系：ddH2O 6μl，2×Taq MasterMix 10μl，cDNA 2.0μl，上游引物1.0μl，下游引物1.0μl，共计20.0μl。反应条件：95℃预变性5min；95℃变性1min，57℃退火30s，72℃延伸2min，共进行35 个循环；最后72℃再延伸10min，然后将PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，观察并记录结果。

2.4 ALV-J-gp85 基因扩增克隆

2.4.1 ALV-J-gp85 基因PT-PCR 扩增

将2.1 中确定的ALV-J 阳性样品用ALV-J-gp85 引物进行RT-PCR 扩增，反应体系：2×Taq MasterMix 25μl，ddH2O 17μl，cDNA 4.0μl，上游引物2μl，下游引物2μl，总体系50μl。反应条件：95℃5min；95℃30s，62℃退火30s，72℃1min，共进行35 个循环；72℃终延伸10min。反应结束后产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。

2.4.2 ALV-J-gp85 基因的克隆及测序

将2.4.1 中ALV-J-gp85 RT-PCR 反应的产物经电泳后得到的条带进行割胶后参照生工胶回收纯化试剂盒说明书进行胶回收。并将其连接到pMD-19T 载体上，连接体系（10.0μl）：目的片段5μl、Solution I 4.5μl、pMD-19T 0.5μl，加完体系后瞬时离心混匀，放入金属恒温仪16℃连接过夜。把连接好的重组质粒转入DH5α 感受态细胞后挑取单个菌落置于含氨苄抗性的液体LB 培养基过夜培养，用ALV-J-gp85 引物进行菌液PCR 扩增。菌液PCR 反应体系和程序同2.4.1，反应结束后将PCR 产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，然后将阳性重组质粒送到生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

2.5 ALV-J-gp85 基因序列分析

在GenBank 下载14 株ALV 各亚型毒株作为参考序列，将测序所得的ALV-J-gp85 基因序列利用DNAStar 软件中的MegAlign 与下载的ALV 各亚型毒株的gp85 基因通过同源性和系统进化树进行比对分析，参考序列信息见表3。

表3 ALV 参考毒株信息

3 结果与分析

3.1 ALV p27 抗原ELISA 检测结果

由公式计算出样品平均OD450nm 值≥0.3927 时判为阳性，由此判定出26 份血清ALV p27 均为阴性，阳性率0（0/26）。其中有一份高脚鸡血清OD450nm 值为0.39，选择这份血清进行后续试验。

3.2 RT-PCR 扩增结果

根据RT-PCR 反应体系与条件，PCR 产物经过1%琼脂糖凝胶电泳检测，ALV 通用引物在422bp 处出现特异性条带，与预期相符合，见图1。然后再将样品用ALV-J-gp85 引物进行RT-PCR 扩增，PCR 产物经过1%琼脂糖凝胶电泳检测，样品在931bp 左右出现条带，与预期相符，见图2。对该ALV-J-gp85 基因进行克隆和测序，并命名为GZAS20200701。

图1 高脚鸡ALV RT-PCR 检测结果

3.3 同源性分析

利用生物学软件Megalign 对该序列与从GenBanK 下载的14 株ALV 毒株进行同源性比对分析，结果如图3 所示。其中同源性最高的为ALV-J 中的LYJ195 株，达99.5%（命名为：GZAS20200701），而与ALV-B 中的GD08 株同源性最低，为48.5%。序列与A、C、D、E、K 亚型的同源性在48.8%～50.8%之间，同源性较低。

图3 ALV 毒株同源性分析结果

3.4 系统进化树分析

根据GenBank 发布的序列，下载其中14 株ALV 毒株与序列（命名为：GZAS20200701）构建系统进化树进行比对分析，结果如图4 所示。该序列与ALV J 亚型中的LYJ15 株属于同一分支，与LYJ195 株又同属于另一个分支，说明该序列与LYJ15和LYJ195 毒株亲缘关系较近，处于同一个分支。而与其他亚型的ALV 亲缘关系较远，处在2 个大的分支中关系最远的分支。

图4 ALV 毒株遗传进化树分析

4 讨论与结论

我国幅员辽阔，地方鸡品种丰富，高脚鸡作为贵州地方品种，由于其独有的风味、质量优异、价格合理等原因深受广大消费者青睐，有广阔的市场发展前景。但ALV 对养鸡业的威胁仍然存在，且J 亚型的ALV 感染更为广泛，我们应做好高脚鸡净化工作，以防ALV-J 传播范围扩大。未来应加强对高脚鸡的监测，将样本范围和样本量进行扩大，全面了解高脚鸡感染禽白血病的状况，做好禽白血病净化的日常工作，将高脚鸡地方品种优越性发挥出来，使高脚鸡得到更好的发展。

试验对26 份高脚鸡血清进行ALV p27 抗原ELISA 检测，ELISA 中并未检测出阳性，但检测结果中有一份非常接近阳性，将其提取RNA 进行反转录后用ALV-A/B/J 引物进行扩增，扩增出422bp 的条带，与ALV-J 目的大小相符。说明该ALV p27抗原ELISA 检测试剂盒与PCR 相比特异敏感性稍低。用ALV-J-gp85 引物对该样品扩增出大小为931bp 左右的产物，将其克隆并命名为GZAS20200701。将GZAS20200701 与Gen-Bank 发布的 ALV -gp85 基因序列进行比对分析，GZAS20200701 与ALV-J 亚型的同源性为99.5%，说明本试验从送检的高脚鸡血清样本中扩增到的GZAS20200701 株属于ALV-J。

20 世纪80 年代末期，自英国分离发现J 亚群禽白血病以来，该病毒在世界各地均有存在[7]。我国第一次发现ALV-J 是在20 世纪90 年代末，研究人员从肉鸡体内分离得到，此后在山东、宁夏等多个省发现此病。随着ALV 宿主范围逐渐变大，不止在一些商品化蛋鸡和地方品种鸡中发现该病毒，在一些野鸟体内也发现了该病毒。gp85 基因在ALV-J 感染宿主细胞黏附和诱导机体产生特异性抗体中起重要作用，gp85 作为病毒囊膜蛋白表面的主要成分，gp85 含有的病毒-受体簇决定了病毒亚群的特异性及宿主范围，整个gp85 基因也是高度可变的。因为病毒gp85 基因决定了病毒亚群的特异性，并编码ALV 与受体决定因子结合形成决定簇，决定禽白血病病毒的宿主范围，因此，通过检测gp85 基因可以确定鸡群是否感染ALV-J。Wang（2006）等 发 现，ALV-J gp85 基因在抗体选择性压力下会发生变化。ALV 是反转录病毒，env 基因的变异同时会导致ALV-J 毒株发生变异，而决定亚群特异性的gp85 序列由于存在高变区，很容易发生变异。2015年Dong 等发现鹧鸪小腿鸡中存在ALV-J 感染，同时发现骨髓细胞瘤、骨髓瘤和纤维肉瘤[8]。2017 年Li 等发现，ALV-J 在感染个体之间会发生变化[9]。2019 年王元红等在对一株J 亚型ALV gp85 基因序列进行分析，同时也预示ALV 的变异一直处于缓慢的演化[10]。目前，禽白血病病毒J 亚群依然对我国及世界各地养禽业造成重大威胁。本试验为在分子水平方向深入研究ALV-J-gp85 基因奠定了一定的理论基础，同时也提供一定的数据参考。