结直肠腺瘤中的miR- 218- 5p 表达研究

朱海龙 朱旭友

1.上海市闵行区肿瘤医院肿瘤内科，上海 200240；2.上海市同济医院病理科，上海 200065

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是世界范围内的常见恶性肿瘤之一。 据统计，全球每年CRC 新发病例约120 万[1]。我国CRC 的发病率和死亡率呈逐年上升之态势，已成为国民健康的主要威胁之一[2]。 Fearon和Vogelstein 提出的正常黏膜-腺瘤-癌通路被视作CRC 的经典遗传模型[3]。 近年来，随着锯齿状腺癌（serrated adenocarcinoma，SAC） 概念的提出， 尤其是SAC 正式列为CRC 的独立亚型以来， 一种被称作锯齿状通路的全新遗传模式进入人们的视野[4]。然而，无论是传统的腺瘤-癌通路，还是新近的锯齿状通路，都认为CRC 来自于腺瘤的恶性演变[5]。但到目前为止，推动CRA 癌变的分子机制尚未完全阐明。其中APC、p53、KRAS、BRAF 等基因的突变，以及染色体不稳定性 （chromosomal instability，CIN）、CpG 岛甲基化表型（CpG island methylator phenotype，CIMP） 和微卫星不稳定性（microsatellite instability，MSI）等表观遗传改变被证实为腺瘤癌变的原动力[6]。 最近多项研究显示[7-11]，miR-218 在CRC、腺瘤和正常组织中存在差异化表达，并证实miR-218 具有抑癌作用，提示miR-218是潜在的CRC 调控靶点。 但miR-218 在结直肠腺瘤（colorectal adenoma，CRA） 中的研究却鲜有报道。 因此，本研究在检测miR-218 成熟体miR-218-5p 表达的基础上，分析不同病理参数下的miR-218-5p 表达差异，为CRA 癌变机制的阐明提供参考资料。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选取2011 年1 月至2013 年12 月上海市同济医院的16 例结直肠腺瘤CRA 及8 例非腺瘤（non-adenoma，NA）石蜡组织作为研究对象，16 例 CRA 中，8例为传统腺瘤（conventional adenoma，CA），8 例为锯齿状腺瘤（serrated adenoma，SA）。 依据 2010 年版WHO 标准[12]将 CA 分为管状腺瘤（tubular adenoma，TA）、绒毛状腺瘤（villous adenoma，VA）和管状绒毛状腺瘤（tubulovillous adenoma，TVA）；SA 分为无蒂锯齿状腺瘤（sessile serrated adenoma，SSA）和传统锯齿状腺瘤（traditional serrated adenoma，TSA）。 本研究经医院医学伦理委员会审核批准。

1.2 试剂设备

石蜡包埋组织RNA 提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司、SYBRTMPremix Ex TaqTM及 Prime-ScriptTMRT reagent Kit 购自宝生物工程（大连）有限公司 、U6 snRNA qPCR Primer 及 hsa-miR-218-5p qRT-PCR Primer 购自广州市锐博生物科技有限公司；轮转切片机RM-2235 型（德国 Leica 公司）、显微镜及拍照 Eclipse TI-s 系统（日本 Nikon 公司）、PCR仪GeneAmpR9700 型（美国 Applied Biosystems 公司）、Real time PCR 仪 LightCycler 1.5 型（瑞士 Roche 公司）、低温高速离心机（德国Eppendorf 公司）。

1.3 miR-218-5p 表达检测

参考TIANGENRRNAprep Pure FFPE Kit 说明书，经组织脱蜡、洗涤二甲苯、裂解蛋白、去除DNA 及蛋白、溶解收集等步骤提取石蜡组织RNA。随后以RNA为模板， 参照 PrimeScriptTMRT reagent Kit 及 Bulge-LoopTMmiRNA qRT-PCT Primer 说明书，利用 PCR仪，调整反应参数为42℃ 60 min，70℃ 10 min 进行miR-218-5p 及内参 U6 snRNA 的逆转录（reverse transcription，RT）。 最后以 RT 产物为模板， 参照 SYBRRPremix Ex TaqTM及Bulge-LoopTMmiRNA qRT-PCT Primer 说明书， 利用Real time PCR 仪进行实时定量PCR 反应（Real-Time Quantitative Reverse Transcription PCR，qRT-PCR）， 检测 miR-218-5p 的相对表达量。

1.4 miR-218-5p 表达分析

qRT-PCR 结束后记录各样本的Ct 值。 参考文献报道[13]的方法：以人 U6 snRNA 为内参，ΔCt =miR-218-5p Ct 值-U6 snRNA Ct 值， 同一样本各复孔的－ΔCt 平均值即为miR-218-5p 的相对表达量。

1.5 观察指标及评价标准

分析比较 NA 与 CRA、NA 与 CA、NA 与 SA 中的miR-218-5p 表达。 评估不同年龄、性别，尺寸、位置、数量、病理类型，以及是否伴发同时性CRC（synchronous colorectal carcinoma，sCRC）等亚组腺瘤中的miR-218-5p 表达差异。 其中息肉尺寸依据结肠镜下的观察记录，取最大直径作为息肉尺寸；息肉的位置同样依据结肠镜下的观察记录，分为近端（包括盲肠、升结肠、横结肠）和远端（降结肠、乙状结肠、直肠）。

1.6 统计学方法

采用Prism 6.0 软件制图，采用SPSS 17.0 统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（）表示，组间比较采用独立样本t 检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-218-5p 在 CRA 与 NA 中的表达比较

24 例石蜡组织中，有 8 例 CRA（SA 与 CA 各 4例）和7 例NA 能提取出符合纯度要求的RNA，且成功完成 qRT-PCR 检测。 结果显示：CRA 与 NA 两 组的miR-218-5p 表达比较，差异无统计学意义（P＞0.05，图 1A）。 亚组分析显示：CA 与 NA 两组的 miR-218-5p 表达比较，差异无统计学意义（P＞0.05，图 1B）；而SA 组中的miR-218-5p 表达低于NA 组，差异有统计学意义（t=3.478，P=0.007，图 1C）。

图1 miR-218-5p 在CRA 与 NA 中的表达比较

2.2 不同病理特征的miR-218-5p 表达比较

不同性别、年龄、尺寸、位置、数量及病理类型情况下的miR-218-5p 表达比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。 伴发 sCRC 的 CRA 中的 miR-218-5p 表达低于不伴sCRC 的CRA，差异有统计学意义（t=2.556，P=0.043）（表 1）。

表1 不同病理特征的miR-218-5p 表达比较（n=8）

3 讨论

CRC 是世界范围内的主要肿瘤，其发病率位居全球恶性肿瘤第三位[4]。 研究证实[6]，CRC 是因错配修复、原癌、抑癌等诸多基因突变所致的异质性疾病。目前，APC、p53、KRAS、BRAF 突变， 以及 CIN、CIMP、MSI 等分子事件被证实与CRA 癌变有关[14-16]。但CRC形成的分子机制远未被完全阐明。最近Gattolliat 等[17]利用qRT-PCR 技术证实CRA 和CRC 之间存在差异表达的 miRNA。 与此同时，Slattery 等[13]以 Agilent Human miRNA Microarray V19.0 为平台进行差异miRNA 筛选， 结果显示CRA、CRC 与正常黏膜之间同样存在差异表达的miRNA，提示miRNA 可能参与正常黏膜-CRA-CRC 的恶性演变。miR-218 是位于SLIT2/3基因编码区的内含子miRNA。成熟的miR-218 来自两个独立的基因座，其中miR-218-1 位于染色体4p15.31 的 SLIT2 基因编码区，miR-218-2 则位于染色体5q35.1 的SLIT3 基因编码区，而 miR-218-5p 是两者共同的成熟体[18]。 作为miRNA 的成员之一，研究证实miR-218-5p 与胃癌、 肝癌、CRC 等众多肿瘤的增殖、转移相关[5-9]。 Deng 等[8]的研究显示，胃癌中的miR-218 存在下调表达，而且低表达的miR-218 与较晚的临床分期、淋巴结转移、远处转移，以及不良的生存预后相关； 上调miR-218 的表达不仅可以诱导胃癌细胞发生G1 期阻滞、抑制胃癌细胞增殖，还能调控胃癌的生长和转移。 Ting 等[7]对肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）中的 miR-218 表达进行了研究，结果HCC 中的miR-218 表达下调；功能获得试验显示， 提高miR-218 在HCC 细胞中的表达可抑制细胞的侵袭迁移，并能逆转上皮-间质转化（epithelialmesenchymal transition，EMT）。 此外，Zhang 等[7]对 CRC组织和细胞的miR-218 表达进行了检测， 证实了miR-218 在 CRC 中同样存在下调表达，miR-218 过表达可抑制CRC 细胞LoVo 的增殖、侵袭及迁移。 进一步研究提示，miR-218 可能通过调控PI3K/Akt/mTOR 通路活性来实现其抑癌作用。 本研究结果显示，伴发sCRC 的腺瘤组织miR-218-5p 表达量低于不伴癌的腺瘤组织（P=0.043），与上述文献报道相似。 本研究结果还显示，作为CRA 亚型之一的SA，其miR-218-5p 表达较NA 下调，差异有统计学意义（P=0.007）； 而 miR-218-5p 在 CA 和 NA 中的表达比较，差异无统计学意义，提示SA 是有别于CA 的独特CRA亚型。

综上所述，miR-218-5p 在 CRA 亚型 SA，以及伴有sCRC 的腺瘤中表达下调， 提示miR-218-5p 可能成为SA 诊断的候选指标。 此外需要说明的是，相较新鲜组织，使用石蜡组织提取RNA 要困难的多，这是造成本研究样本量偏少，导致研究结果局限的关键因素，也是今后深入研究中亟需改进的问题。