犊牦牛副伤寒病原分离鉴定及药敏试验

马艳萍，黄全云，汪昌燕，李 剑，韩青忠，阚 威★

（1.青海省动物疫病预防控制中心 810001；2.青海省祁连县动物疫病预防控制中心 810499）

作为一种人畜共患病，犊牦牛副伤寒的致病菌为都柏林沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌，表现多以胃肠炎及败血症为主，胃肠炎以下痢为临床代表性症状，故又称为“犊牛拉稀病”[1]。犊牦牛病起初的临床表现为心跳过快、体温升高，呼吸急促，精神懒散，食欲较差，可见腹式呼吸，并且伴有腹泻等症状，排出稀粪，可闻极恶臭。成年牛发病大部分都是以急性败血症出现，疾病过程又急又短，症状猛烈，死亡几率很高，若是人类对病牛肉进行食用，则会造成食物中毒[2]。本病对各年龄阶段的牛均有易感性，特别是1月龄左右的犊牦牛患病的几率较高。该疾病的传染源以病牛、带菌牛为主，都柏林沙门氏菌长时间藏匿于带菌牛的胆囊里，而且不断地随着粪便一起排出，但是鼠伤寒沙门氏菌或许源自于饮水、环境、其他的动物等。此疾病的传染途径以消化道为主。除此以外，带菌牛在潮湿、气候突变等不良外界条件的干扰之下，亦有出现内源性传染的可能性。犊牛没有饮初乳或是饮初乳量过少，也会使其自身的抵抗力减弱，从而引发此疾病。本病的发生与季节之间没有较大的关联性，而且可以快速传播，往往表现为地方性流行。成年牛放牧季节，一般多为散发性。上个世纪50年代，此疾病在我们国家牦牛产区开始流行，而且在70、80年代出现发病高峰，发病率、死亡率分别为15%～65%、30%～85%，致使养殖户损失惨重[3]。

自2019年6月份起，青海省祁连县野五个乡镇即牛沟乡、央隆乡、峨堡镇、默勒镇、八宝镇等都出现了生犊牛腹泻的情况，而且发病牛大多都在2月龄以内，表现为没有规律的散发状态，一些患畜会拉稀，排出稀粪，而且呈黏液状，黄绿色或者黄白色，并呈腹式呼吸，部分犊牦牛还有皮肤真菌感染。通过实地走访调查发病情况，采集已死亡犊牦牛患病脏器1份，进行了实验室细菌学分离鉴定，最终确定病原为鼠伤寒沙门氏菌，同时对分离株细菌进行了药敏试验，以便对犊牦牛副伤寒的临床治疗和综合防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 待检材料

无菌采集死亡犊牦牛患病脏器（肝、肺）1份，作为试验检测病料。

1.1.2 主要试剂和设备

试剂：营养琼脂培养基、伊红美蓝琼脂培养基、HE琼脂培养基、三糖铁斜面、血琼脂平板、MH琼脂培养基和MH液体培养基；细菌微量生化鉴定管、K-B法药敏纸片（26种），0.5麦氏比浊管，均购于杭州微生物试剂有限公司；DNA提取试剂盒、琼脂糖、2000DNA Marker、50×TAE、PCR反应预混酶，均购于北京全式金公司。

设备：恒温培养箱、显微镜、PCR扩增仪(Bio-RAD，Mexico)，水浴恒温振荡器，凝胶成像系统（Bio-RAD，USA），DYY-12型电脑三恒多用电泳仪、DYCP-31A型电泳槽(北京六一仪器厂)。

1.1.3 引物合成

针对相关文献[4]的参考，通过运用南京金斯瑞生物科技有限公司合成细菌鉴定对通用引物16S rRNA基因引物，相关序列以及大小等见下表1能够具体体现出来。

表1 16S rRNA基因PCR扩增引物

1.2 方法

1.2.1 病料触片镜检

将肝脏和肺脏病变部位触片酒精火焰固定之后，做革兰氏染色镜检。

1.2.2 病原分离培养

将肝脏、肺脏接种于营养肉汤增菌；取24h的肝脏、肺脏增菌营养肉汤培养物划线接种于营养琼脂平板做纯化培养；纯化菌落划线接种于伊红美蓝琼脂平板、HE琼脂平板、三糖铁斜面、血琼脂平板，在37℃条件下完成24h的培养之后，对菌落的形态进行观察；随机选出疑似目标单菌落接种于营养肉汤以及MH液体培养基，进行24h的培养，涂片革兰氏染色镜检。

1.2.3 生化鉴定

参考《兽医微生物》第四版[5]，沙门菌属生化特性鉴定表。将血清肉汤24h培养物按照《肠杆菌科细菌生化鉴定管说明书》（杭州微生物试剂有限公司），接种于生化反应管，观察反应结果。见下表2。

表2 沙门菌属生理生化指标

1.2.4 16S rRNA基因PCR扩增及测序

将纯化之后的营养肉汤培养物作为参考，并依照细菌DNA进行试验，提取其细菌基因组，运用在PCR反应模板中。16S rRNA基因PCR扩增体系是50µL：PCR预混酶、双蒸水、DNA模板分别为25µL、 21µL、2µL，而上、下游引物则各为1µL。PCR扩增条件：95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，需循环30次；72℃10 min。目的条带大小为194bp，PCR产物的测序工作由北京奥科鼎盛生物科技有限公司完成，将所获结果在NCBI数据库里做Blast比较分析。

1.2.5药敏试验

药敏试验对Kirby—Bauer法进行了运用。选用单个菌落接种在MH液体培养基中，通过对37℃的温度实施16h的培养，并且还要把菌液浓度调制成0.5麦氏单位（1.0×108CFU/mL）。移取200μL，借助移液器来完成，紧接着用涂菌棒在M-H琼脂平板上进行匀称涂布，待培养基表面干燥之后放置药敏纸片，使之与该表面紧密相贴，在37℃的条件下进行24h的培养，对抑菌圈直径进行测定，借助游标卡尺来完成，并基于对杭州微生物试剂有限公司所供的药敏试验纸片法的抑菌范围解释标准的参考，就分离菌对药物的敏感性做出判断。

2 结果与分析

2.1 病料镜检和粪便虫卵检查结果

病料当中都能够把革兰氏阴性直杆菌检测出来，散在。

2.2 病原分离培养及菌落形态特征

通过肺脏对株细菌进行分离，利用营养琼脂平板能够见其成圆形隆起、湿润、光滑、边缘齐整、半透明光泽、灰白色菌落； HE琼脂平板上表现为琥铂色菌落；在伊红美蓝琼脂平板上表现为无色菌落；血琼脂平板上呈无溶血现象。

2.3 生化鉴定结果

表3 分离株细菌生化鉴定试验结果统计表

2.4 16S rRNA基因扩增结果

图4 分离株细菌16S rRNA PCR扩增结果

2.5 16S rRNA基因同源性及系统发育分析结果

对分离菌株细菌16S r RNA基因做测序，结果发现该基因序列在线Blast分析表明，其16S r RNA基因序列与Gen Bank上已登录(Accession No:NR116126、NR074910、NR074799)的鼠伤寒沙门氏菌的相应序列之间存在高度同源性（≥99.0%)。结果表明，由分离株细菌形态特点、生理生化特性、16S r RNA测序结果可以判断其为鼠伤寒沙门氏菌。

2.6 药敏试验结果

结果表明，分离株鼠伤寒沙门氏菌对丁胺卡那霉素、头孢哌酮、头孢他啶、多粘菌素B高度敏感；对诺氟沙星、氧氟沙星、呋喃唑酮、环丙沙星、哌拉西林中度敏感；对青霉素、新霉素、卡那霉素、氨苄西林、克林霉素、头孢唑啉、羧苄西林、头孢氨苄、麦迪霉素、氯霉素、多西环素、四环素、苯唑西林、庆大霉素、头孢拉定、红霉素、万古霉素具有耐药性。

3 分析与讨论

犊牛副伤寒病于19世纪中期在欧洲各地发生，都柏林沙门氏菌与鼠伤寒沙门氏菌混合存在，其分布比例随年代好国家而异，在欧洲大约以都柏林沙门氏菌占多数，日本1937～1940年在东北的北部大群发生犊牛感染肠炎沙门氏菌，但其后几乎无此病发生。然而，日本自1965年兵库县成群集中育肥的乳用种犊牛流行由鼠伤寒沙门氏菌引起的重症下痢以来，本病在日本公牛犊集中肥育群中特别多发。据文献报道，在上个世纪50年代，该病症在我国牦牛产区广为流传，并且在70、80年代期间比较盛行，发病率、死亡率分别为15%～65%、30%～85%，致使养殖户的经济收益大为受损。在20世纪80年代，我省黄南州、海南州、海北州、果洛州等地报道有犊牦牛副伤寒病呈爆发流行。作为青藏高原特有的物种，牦牛是当地牧民经济收入的关键来源。现如今，在青藏高原牦牛繁殖区由沙门氏菌所致的以高热、下痢、昏迷为特征的疾病已经对牦牛产业的发展造成了不小的干扰。自2019年6月份以来在祁连县央隆乡、野牛沟乡、默勒镇、峨堡镇、八宝镇五个乡镇陆续发生牦牛腹泻症状，波及31个牧户和1个牧业公司，发病率在5%～16.1%，死亡率在12.5%～35.4%。结合临床症状，初步怀疑为犊牦牛副伤寒引起的腹泻，后经实验室细菌分离培养及生化实验等鉴定，确切诊断为因鼠伤寒沙门氏菌引发的该疾病所致。

从此次对分离株细菌的药敏试验结果可以看出，该分离株细菌对丁胺卡那霉素、头孢哌酮、头孢他啶、多粘菌素B的敏感度比较高。故而，在临床应用上，防制犊牦牛副伤寒应选择药敏试验敏感性药物，交替使用。

就此次分离得到的沙门氏菌而言，引起该病的沙门氏菌不只是这一种，都柏林沙门氏菌、肠炎沙门氏菌都有可能引起牦牛致病，因此建议兽医主管部门和科技部门引起对该病予以重视，建议设置专项研究课题，全面系统的进行该病的流行病学调查和病原学诊断分析，才能全面的指导该病的防控工作。