HPLC同时测定七清败毒颗粒中黄芩苷和虎杖苷的含量

林万华，刘 翠，张 文，林 昊，王珍珍

（1.广东容大生物股份有限公司 511517；2.华南农业大学 510640；3.清远一生自然生物研究院有限公司 511517）

七清败毒颗粒是中兽药经典处方，由黄芩、虎杖、白头翁、苦参、板蓝根、绵马贯众、大青叶七味中药材组成，具有清热解毒，燥湿止泻的功效[1-2]，对畜禽多种细菌、病毒性疾病具有较好的防治效果，如白痢、感冒、传染性支气管炎等。本中药配伍中黄芩和虎杖的象征成分为黄芩苷和虎杖苷；因此，鉴定黄芩苷和虎杖苷成分作为七清败毒颗粒颗粒质量判定依据。《中国兽药典》2015版二部对七清败毒颗粒质量判定标准是采用薄层色谱法，分别检测其中是否含有黄芩苷、虎杖苷等成分[1][3]，此鉴别方法较繁琐，并未对黄芩苷和虎杖苷做含量测定。为科学准确评价七清败毒颗粒质量，本试验采用HPLC法对七清败毒颗粒中黄芩苷和虎杖苷含量同时测定的方法进行了研究。

1 仪器与材料

日本岛津LC-20A高效液相色谱仪；超纯水仪UPK-5T；超声波仪；梅特勒—托利多天平MS105DU；黄芩苷对照品：Z0271109，中国兽医药品监察所；虎杖苷对照品：111575-201603，中国食品药品检定研究院；样品：七清败毒颗粒2012003，广东容大生物股份有限公司；试剂：甲醇、乙腈、磷酸为色谱纯，水为分析用纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

流动相：乙腈-水-磷酸（25∶75∶0.1），色谱柱：岛津C18 5u 4.6×250mm，检测波长：315nm，流速：1.0mL/min，柱温：30℃，进样量：20μL

2.2 对照品溶液的配制

2.2.1 稀释液：甲醇

2.2.2 黄芩苷对照品储备液：精密称取黄芩苷对照品10.0mg，置25mL棕色量瓶中，加甲醇使溶解并定容至刻度，摇匀，作为黄芩苷对照品储备液。

2.2.3 虎杖苷对照品储备液：精密称取虎杖苷对照品10.0mg，置25mL棕色量瓶中，加甲醇使溶解并定容至刻度，摇匀，作为虎杖苷对照品储备液。

2.2.4 混合对照品溶液：取上述1.3.2项下的对照品储备液5.0mL及1.3.3项下对照品储备液1.0mL到50mL容量瓶中，加稀释液定容，摇匀，制成含黄芩苷40µg/mL、虎杖苷8µg/mL的混合对照品溶液。

2.3 样品溶液的配制

取七清败毒颗粒适量，研细，置100mL棕色量瓶中，加甲醇40mL，超声处理（功率500W，频率40kHz）30min，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 系统适用性试验

2.4.1 黄芩苷、虎杖苷系统适用性

取上述1.3.4项下的混合对照品溶液20µL按1. 2色谱条件下进样，测定并计算柱效、分离度和拖尾因子（具体数据见表1）。

表1 黄芩苷、虎杖苷系统适用性试验测定结果

2.5 线性实验

2.5.1 黄芩苷、虎杖苷线性实验

取上述1.3.2项黄芩苷对照品储备溶液及1.3.3虎杖苷对照品储备液分别稀释成含黄芩苷5.00µg/mL、10.00µg/mL、20.00µg/mL、40.00µg/mL、100.00µg/mL，虎 杖 苷1.00µg/mL、2.00µg/mL、4.00µg/mL、8.00µg/mL、20.00µg/mL的系列混合对照品溶液，按1.2色谱条件测定，以峰面积对浓度进行线性比较，黄芩苷峰面积的回归方程为：Y＝54836X-115539（R2＝0.9997），说明黄芩苷在5～100µg/mL范围内具有良好的线性关系（具体见图1），虎杖苷峰面积的回归方程为：Y＝109836X-11176（R2＝0.9999），说明虎杖苷在1～20µg/mL范围内具有良好的线性关系（具体见图2）。

图1 黄芩苷线性范围数据图

图2 虎杖苷线性范围数据图

2.5.2 黄芩苷、虎杖苷测定线性色谱图

图3 黄芩苷、虎杖苷测定线性液相色谱图

2.6 重复性试验

2.6.1 黄芩苷、虎杖苷重复性试验

精密吸取1.3.4混合对照品溶液适量，按1. 2项色谱条件测定，进样5次，获得黄芩苷峰面积的RSD为0.1%，虎杖苷峰面积的RSD为0.09%，表明该色谱条件对黄芩苷和虎杖苷检测的重复性良好。具体见表2。

表2 黄芩苷进样重复性数据

2.7 回收率试验

2.7.1 黄芩苷、虎杖苷回收率试验

精密取已知黄芩苷含量（6.5mg/mL）、虎杖苷含量（0.78mg/mL）的同一批样品约0.50g（共9份）置于100mL容量瓶中，分别加入上述1.3.2项下的对照品储备液4.0mL、5.0mL、6.0mL及1.3.3项下对照品储备液0.8mL、1.0mL、1.2mL，按上述1.4项要求处理，进样测定。测定并计算黄芩苷的平均回收率为99.9% ，虎杖苷的平均回收率为100.06%。具体见表3、表4。

表3 黄芩苷回收率试验数据

表4 虎杖苷回收率试验数据

2.8 混合对照品溶液的测定

取上述1.3.4项下的黄芩苷、虎杖苷混合对照品溶液，按1.2色谱条件下进样，测得黄芩苷、虎杖苷混合对照品色谱图谱如下（图4）。

图4 黄芩苷、虎杖苷液相色谱图

2.9 供试品的测定

取3批七清败毒颗粒样品及对照品溶液，按外标法测定，每批样品进样2次，计算样品中黄芩苷、虎杖苷含量（图谱见图5）。3批七清败毒颗粒样品的含量测定结果分别为黄芩苷6.51mg/g、6.50mg/g、6.51mg/g，虎杖苷0.78 mg/g、0.78mg/g、0.79mg/g。

图5 七清败毒颗粒样品的液相色谱图

3 讨论

3.1黄芩药材中的黄芩苷含量测定液相条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（C18色谱柱），以甲醇-水-磷酸（47∶53∶0.2）为流动相；检测波长为280nm；虎杖药材中虎杖苷含量测定液相条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水（23∶77）为流动相；检测波长为306nm[1]。黄芩苷在波长为280nm、316nm处有最大吸收，虎杖苷在217nm、306nm、314nm处有最大吸收。从药典中可以明确，黄芩苷的含量测定采用280nm作为检测波长，而虎杖苷则选择了306nm作为检测波长。本方法参考了药典检测条件，选择了315nm波长兼顾两个被测成分在314nm～316nm中有最大吸收，以保证检测的最大灵敏度。

3.2 在流动相确立方面，参考了中国兽药典黄芩苷、虎杖苷检测的色谱条件，结合侯丽丽[2]、黄良永[5]等方法研究结果，确立了高效液相色谱法同时测定七清败毒颗粒中黄芩苷、虎杖苷含量的方法：乙腈—水—磷酸（25∶75∶0.1），色谱柱：岛津C18 5u 4.6×250mm，检测波长：315nm，流速：1.0mL/min，柱温：30℃，进样量：20µL；其中在流动相中增加0.1%的磷酸，起到适当调节流动相的pH改变色谱峰型作用。

3.3为避免黄芩苷与虎杖苷两个物质的检测响应值相互影响，特做了两个标准品的浓度检测尝试，最终确立黄芩苷在浓度为 5～100µg/mL，虎杖苷在浓度为 1～20µg/mL范围内线性关系良好，检测峰相应值大小相当，积分条件统一。该方法具有线性范围宽、分析时间短、样品前处理简便、定量结果准确、重现性好等特点，为其质量判定提供了更科学的依据。