特应性皮炎不同T细胞亚群平衡紊乱与中医证型关联及YAP对其调控作用的研究

贾金靖，叶思祺，张瑜，晏烽根，刘俊峰，莫秀梅，李红毅，陈达灿

[广州中医药大学第二附属医院（省部共建中医湿证国家重点实验室，广东省中医药防治难治性慢病重点实验室），广东 广州 510120]

特应性皮炎（Atopic dermatitis，AD）是一种慢性、复发性、瘙痒性皮肤疾病，目前其确切发病机制尚不明确，既往认为是以辅助性T细胞（Th）2为主的免疫反应，并释放一系列细胞因子，引起Th1/Th2调节失衡[1]，进一步加重屏障功能障碍形成恶性循环。新近研究表明，Th17和调节性T细胞（Treg）在AD急、慢性期的数量、功能差异在其发病机制中发挥重要作用[2]，构成一个复杂庞大的Th1/Th2/Th17/Treg免疫调控网络。Yes相关蛋白（YAP）是Hippo信号通路下游的关键成员。以往的研究多集中在肿瘤领域[3]，在AD中所起的作用尚未见报道。近来研究表明，Hippo信号通路在Th17及Treg的分化中发挥重要作用[4-7]，YAP作为Hippo通路的效应分子，很可能是维持这一平衡的关键因素。

AD 属于中医“四弯风”、“奶癣”、“胎敛疮”等的范畴[8]。AD急性期通常辨为心脾积热证或心火脾虚证；慢性期通常辨为脾虚蕴湿证或血虚风燥证。本文研究AD不同中医证型之间Th1/Th2/Th17/Treg的比例以及YAP表达量对其平衡紊乱的影响，探讨其特征及机制，有利于深入了解中医辨证分型的本质，从而指导临床更合理选方，提高疗效。

1 材料与方法

1.1 一般资料 收集AD患者35例，其中男22例，女 13例，年龄 6～46岁，平均（18.12±1.49）岁，病程0.5～20年，平均（6.61±0.85）年。均符合 Williams诊断标准[9]，排除合并感染性疾病、其他脏器或血液系统等严重原发性疾病、恶性肿瘤，或者合并需要治疗的其他皮肤病，孕妇或处于哺乳期者，近1个月内未服用糖皮质激素、免疫抑制剂。健康对照者24例，男 12例，女12例，年龄 6～26岁，平均（20.96±1.16）岁。所有入组者均征求本人同意并签署知情同意书（18岁以下患者由其父母或监护人签字）并获广东省中医院伦理委员会批准。中医证型诊断标准参照《特应性皮炎中医诊疗方案专家共识》[10]，将AD患者分为心火脾虚证21例，其中男13例，女8例，年龄 6～46岁，平均（19.71±1.87）岁，病程 0.5～20.0年，平均（7.54±1.22）年；脾虚蕴湿证 9例，其中男6例，女3例，年龄 6～27岁，平均（14.11±3.11）岁，病程0.5～13年，平均（4.89±1.34）年；血虚风燥证5例，其中男3例，女2例，年龄10～24岁，平均（16.80±3.07）岁，病程 1～11 年，平均（5.80±1.78）年。病情采用AD严重程度评分（SCORAD）法计算。

1.2 方法

1.2.1 酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测血清中细胞因子含量 患者及健康对照者均抽取外周静脉血40～50mL，一部分静置后2000r/min，离心10min，离心半径9.5 cm，小心吸取血清。按照ELISA试剂盒（武汉EIAab科技有限公司）说明书进行操作，检测人血清中Th1相关细胞因子 [干扰素（IFN）-γ]、Th2 相关细胞因子[白细胞介素（IL）-4]、Th17 相关细胞因子（IL-6、IL-17A、IL-21）、Treg相关细胞因子[转化生长因子（TGF）-β、IL-2、IL-10]的水平。

1.2.2 Th1/Th2/Th17/Treg比例测定 患者及健康对照者外周静血用Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（PBMC），使用流式细胞仪进行各细胞亚群比例的测定，用不同的单克隆抗体进行标记后检测，其中 CD3+CD4+IFN-γ+为 Th1，CD3+CD4+IL-4+为 Th2，CD3+CD4+IL-17A+为 Th17，CD3+CD4+CD25+FOXP3+为 Treg。

1.2.3 T细胞亚群细胞的诱导分化 用人Naive CD4+T细胞分离试剂盒（美国Miltenyi Biotec公司）分选PBMC中的Naive CD4+T细胞，再进一步按照Th1分化试剂盒、Th2分化试剂盒、Th17分化试剂盒、Treg分化试剂盒（均来自美国R&Dsystems公司）诱导 Naive CD4+T 细胞向 Th1、Th2、Th17、Treg分化。

1.2.4 实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测YAP mRNA表达情况 用Trizol法提取诱导分化后的不同 T 细胞亚群（Th1、Th2、Th17、Treg）以及小鼠皮损中的总RNA，逆转录合成cDNA，采用SYBR Green试剂盒，在冰面上制备qRT-PCR反应体系，以GAPDH为内参照，qRT-PCR仪检测患者及健康对照者不同T细胞亚群中的YAP mRNA表达情况。所采用的引物序列为YAP：Forward：ATGAGATGGATACAGGTGATAC，Reverse：GGCTTCAAGGTAGTCTGG；GAPDH：Forward：CATCAAGAAGGTGGTGAAG，Reverse：GCTGTTGAAGTCAGAGGAG。

1.3 统计学分析 统计学方法采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。数据以均数±标准误表示；2组间比较采用t检验；3组及以上之间的比较采用方差分析，组间两两比较用LSD检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AD患者及健康对照者的临床特征分析 AD组和健康对照组年龄比较差异无统计学意义（t=-1.169，P=0.247），性别差异无统计学意义（χ2=0.964，P=0.326）；AD不同中医证型组之间性别差异无统计学意义（χ2=0.082，P=0.960），年龄差异无统计学意义（F=1.388，P=0.264），病程差异无统计学意义（F=0.942，P=0.401），嗜酸性粒细胞计数差异无统计学意义（F=0.582，P=0.565），外周血IgE水平差异无统计学意义（F=1.757，P=0.189），SCORAD 差异有统计学意义（F=16.738，P＜0.001），进一步LSD两两比较结果显示：心火脾虚组与脾虚湿蕴组相比P＜0.001，心火脾虚组与血虚风燥组相比P＜0.001，脾虚湿蕴组与血虚风燥组相比 P=0.130。见表 1、2。

表1 AD组和健康对照组的临床特征 例

2.2 AD不同中医证型之间存在Th1/Th2/Th17/Treg平衡紊乱 笔者用流式细胞仪检测Th1/Th2/Th17/Treg细胞占总CD4+T细胞的比例，结果显示：Th1在心火脾虚组轻度降低，在脾虚湿蕴和血虚风燥组升高，但差异无统计学意义；Th2在心火脾虚组显著升高（P＜0.05），在脾虚湿蕴和血虚风燥组降低，但未低于正常对照组水平；Th17同样在心火脾虚组显著升高（P＜0.05），在脾虚湿蕴和血虚风燥组降低，但未低于正常对照组水平；而Treg在心火脾虚组显著降低（P＜0.05），在脾虚湿蕴和血虚风燥组升高，均超过了正常对照组的水平，且在血虚风燥组其升高的程度与正常对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05），见图1A。进一步分析各个中医证型之间Th2/Th1、Th17/Treg比例，结果可见，在心火脾虚组其Th2/Th1及Th17/Treg比例较正常对照组均明显升高（P＜0.05），脾虚湿蕴和血虚风燥组较正常对照组比较差异无统计学意义，见图1B、C。

图1 在AD中存在Th1/Th2/Th17/Treg平衡紊乱

ELISA法检测血清中不同细胞因子的表达，可见Th1相关细胞因子IFN-γ在心火脾虚组显著降低（P＜0.01），在脾虚湿蕴和血虚风燥组升高，但异质性较大，差异无统计学意义；Th2相关细胞因子IL-4在心火脾虚组显著升高（P＜0.001），在脾虚湿蕴和血虚风燥组又回落，但未降至正常对照组水平之下；Th17相关细胞因子中，IL-17A及IL-21在心火脾虚组显著升高（P＜0.01），在脾虚湿蕴和血虚风燥组降低，而IL-6虽然也有这一趋势，但是差异无统计学意义；Treg相关细胞因子中仅IL-10在心火脾虚组显著降低（P＜0.01），在脾虚湿蕴和血虚风燥组又回升，并超过正常对照组水平，其余TGF-β及IL-2均无明显变化，见图2A～H。

图2 ELISA检测血清中不同细胞因子的表达

2.3 YAP在不同T细胞亚群中的表达存在差异 在健康对照组中，可见YAP mRNA在Treg中明显升高，均高于在 Th1、Th17、Treg中的含量（P＜0.05），见图3A；而在AD组中，YAP mRNA在Th17中表达升高，并且高于了在Th1中的表达，与健康对照组相比在Treg中表达降低，与Th1及Th2相比差异无统计学意义，见图3B。进一步对不同中医证型之间YAP表达量作以比较，可见YAP mRNA在Th1及Th2中的表达在不同中医证型之间差异无统计学意义；YAP mRNA在Th17中的表达在心火脾虚组明显升高（P＜0.01），在脾虚湿蕴和血虚风燥组的表达降低，但仍高于正常对照组；YAP mRNA在Treg中的表达在心火脾虚组明显降低（P＜0.05），在脾虚湿蕴和血虚风燥组的表达回升，但未恢复至正常对照组的水平，见图3C。

图3 YAP mRNA在不同T细胞亚群中的表达

表2 AD组中不同中医证型的临床特征 （±s）

表2 AD组中不同中医证型的临床特征 （±s）

注：*P＜0.001 vs.心火脾虚组。

组别 n 男 女 年龄（岁） 病程（年） S C O R A D（分） 嗜酸性粒细胞计数（1 0 9/L，0.0 2～0.5 2） I g E（I U/m L，0～2 0 0）心火脾虚 2 1 1 3 8 1 9.7 1±1.8 7 7.5 4±1.2 2 7 2.5 4±2.1 3 1.3 7±0.2 5 7 4 9 9.6 2±1 8 1 7.4 6脾虚湿蕴 9 6 3 1 4.1 1±3.1 1 4.8 9±1.3 4 5 6.1 1±2.5 3* 0.9 7±1.3 9 2 9 3 1.3 3±1 4 7 4.0 4血虚风燥 5 3 2 1 6.8 0±3.0 7 5.8 0±1.7 8 4 7.2 8±6.8 9* 1.2 6±0.2 3 2 9 2 2.7 8±1 6 4 7.5 2

3 讨论

AD又称为异位性皮炎，其特征为患者的皮肤屏障功能受损、免疫系统功能失调[11]。其受累人群广泛，约有15%的儿童及3%的成人患病[12]。目前中医药在AD的治疗中发挥的作用已经越来越得到国际认可，许多关于AD指南中均提及中医药疗法[13]，认为其是应对诊疗困境中可选择的方法。

AD是一个典型的多因素共同作用的疾病，传统观点认为AD的发病与Th2为主的Th1/Th2失衡有关[1]，而近几年国内外大量研究中得出，Th17及Treg相关细胞因子的失衡也可能是AD发病的重要机制[2]。在AD患者皮损中和PBMC中能检测到IL-17，并且IL-17的水平与AD病情严重程度相关，同时检测AD患者血浆中Th17细胞的数量明显升高，推测Th17细胞及其分泌的IL-17参与AD的发病[14-15]。此后又有研究发现Treg的数量及功能在AD患者中发生改变，推测Treg也参与了AD的发病[16]。如同Th1/Th2平衡一样，Th17/Treg平衡也是维持机体免疫稳态的重要因素。然而究竟是何因素在调控其平衡中发挥关键作用，仍是一个尚未解决的难点。

YAP属于Hippo信号通路下游的关键成员，研究表明其可能通过调节细胞增殖和凋亡、调控组织器官生长发育和大小、调节上皮-间质转化（EMT）、调节细胞间接触抑制、参与干细胞自我更新等途径参与肿瘤的发生、发展，因此YAP基因被认为是一种癌基因[3]。最近，Ni等[4]研究健康人外周血与小鼠脾脏、淋巴结分离的T细胞，发现与Th1、Th2、Th17相比，YAP在Treg中特异性高表达，且对维持Foxp3的表达发挥重要作用。敲除YAP或者加入特异性抑制剂维替泊芬可导致Treg功能失调，进而不能发挥抗肿瘤免疫活性。YAP特异性基因敲除鼠的初始CD4+T 细胞表达 IL-17A、IFN-γ、IL-2 均增加，而Foxp3表达降低。因此推测YAP的表达下调可促进Th17及Th1细胞发育、但抑制Treg产生。Fan等[5]研究发现，肝癌患者外周血中YAP表达上调，并且与Foxp3表达水平及Treg百分比呈正相关。体外实验表明，健康人外周血T细胞中过表达YAP可通过转化生长因子β受体（TGFBR2）促使初始CD4+T细胞向Treg分化。Ramjee等[6]关于心肌梗死的实验印证了缺乏YAP和有PDZ结合基序的转录共激活因子（TAZ）表达的鼠模型中受累心肌的Treg数目减少，这样的鼠心梗后心包炎性反应和心肌纤维化更加严重。Suh等[7]研究了118例胃腺癌标本后得出，肿瘤中YAP的表达与Foxp3的表达和Treg数量正相关，Foxp3表达较高者预后较好。此外，另一个YAP类似物的Hippo通路效应分子TAZ被发现在Th17细胞中特异性高表达，并可作为初始CD4+T细胞向Th17分化的促进因素、但却是Foxp3+Treg表达和功能的抑制因素[17]。Th17/Treg平衡失调是AD发病机制中很关键的一环，YAP作为Hippo通路的效应分子，很可能在维持这一平衡中发挥重要作用。

本研究收集了不同中医证型的AD患者和健康对照者，2组的性别、年龄、病程、嗜酸性粒细胞计数及IgE差异无统计学意义，不过在不同中医证型之间，反映病情严重程度的SCORAD评分差异有统计学意义。目前大部分文献把一个较短时期内皮疹的加重定义为AD的复发或急性期[18-19]，因为SCORAD评分可反映AD皮疹的严重程度，可以间接反应AD病程中的急性发作期和慢性缓解期。进一步研究不同T细胞亚群在各个证型之间比例的差别，可以看到在AD中心火脾虚证Th2细胞比例及其细胞因子IL-4升高明显，在脾虚湿蕴证和血虚风燥证虽有升高但是差异无统计学意义，主要是Th1及其细胞因子IFN-γ升高为主，而在心脾积热证中Th1及其细胞因子IFN-γ反有降低趋势，这与传统认为的AD在急性期是以Th2为主的免疫反应、慢性期是以Th1为主的免疫反应相吻合。Th17及其细胞因子IL-17A、IL-21虽然在整个AD组均有升高，但是在心火脾虚证中升高更显著。Treg及其细胞因子IL-10在心火脾虚证中明显降低，在脾虚湿蕴证和血虚风燥证中反而升高超过了健康对照组。既往有认为在AD中Treg的数量下降及功能抑制[20-22]，或者增加[23-25]、甚至无明显变化[26]的研究报道。既往研究证实YAP对Treg的分化及功能维持至关重要，其下调反而可能是促进Th17发育的因素[4]。笔者的研究证实在健康人群中YAP在Treg中的表达高于其他T细胞亚群，在AD患者中其在Treg中的表达降低，并且在心火脾虚组更明显，可能YAP在Treg中的下调与其分化受组、功能抑制有关，进而不能发挥其抑炎作用，促进了AD的炎性反应加重了病情；而YAP在Th17中的表达在AD组却明显升高，尤其是在心火脾虚组，说明其可能是促使Th17分化和功能的因素。因为在机体中Th17/Treg也是一个动态平衡的过程，IL-2在TGF-β的辅助下可诱导Foxp3的表达，从而维持外周Treg的数量、功能[27]。但在IL-6存在的情况下，TGF-β则促进初始T细胞分化为Th17[28-30]。

综上，本研究发现在AD中存在Th2/Th1、Th17/Treg平衡紊乱，YAP在Treg中的表达下调、Th17中的表达上调很可能是介导AD Th17/Treg平衡向Th17偏移的关键因素，且这一特征在心火脾虚证中更明显。本研究仍有一定的局限性，首先是由于需要的血液标本量较大，主要见于婴儿期AD的心脾积热证未能收集到标本进行研究，缺失了这部分的数据；其次因为在临床中脾虚湿蕴证和血虚风燥证的AD患者所占比例也很低，纳入本研究的样本例数较少，目前的结果仅仅推测出与急性期相关的心火脾虚证差异明显，上述特征并没有区分开脾虚湿蕴证和血虚风燥证二者的差别。本研究为中医辨证分型的标准化、规范化以及选择新药靶点提供了一定的理论基础和实验依据，但仍处在初步探索阶段，还需要更大样本量及更多数据进一步深入探索。