梓醇-川芎嗪方对阿尔茨海默病模型小鼠认知功能的影响

孟胜喜，陈慧泽，王 兵，李文涛，潘卫东，张云云

阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一种以β淀粉样蛋白沉积、神经原纤维缠结和老年斑形成为主要特征的神经退行性疾病[1]。AD是迄今为止痴呆的最常见原因，占所有痴呆的80%[2]。中医药具有多层次、多靶点、多通路作用的特点和优势，在防治AD方面发挥着越来越大的作用，也受到越来越多的关注[3]。中药有效组分是指中药复方中具有相似化学性质或化学结构的对疾病具有治疗作用的一类或多类有效成分群[4]。中药有效组分配伍，不仅避免了传统中药方剂成分复杂等缺点，而且还保留了传统方剂的特点和优势。中药组分配伍是微观的中药复方，是随着中药现代化进程不断发展而出现的新的研究热点[5]。本研究探讨梓醇-川芎嗪方(CL方)对APPswe/PS1dE9双转基因AD模型小鼠认知功能的影响，以期为AD的防治提供新的方法和思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取无特定病原体(SPF)级雄性、APPswe/PS1dE9双转基因小鼠6月龄50只，按照随机数字表法分为模型组、梓醇组、川芎嗪组、CL方组、盐酸多奈哌齐(安理申)组，每组10只。另选10只6月龄C57BL/6J小鼠为对照组。全部动物购自北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号：SCXK(京)2018-0006，所有小鼠均适应性喂养2周后分别单笼喂养，光照/黑暗交替时间12 h/12 h，温度(22±2)℃，相对湿度(60±5)%，自由摄食及饮水。

1.2 药物、试剂与仪器

1.2.1 试验药物 盐酸多奈哌齐(Aricept)，卫材(中国)药业有限公司生产，国药准字H20050978；批号：170508。CL方来源：CL方来源于本课题组长期临床经验总结出来的恒清Ⅱ号方[6-9]。恒清Ⅱ号方的主要组成包括熟地黄15 g、川芎10 g。梓醇在熟地黄中的平均含量为0.267%，因此，15 g熟地黄中含有梓醇0.040 05 g[10]。川芎中川芎嗪含量为0.152 3%，因此10 g川芎中含川芎嗪为0.015 23 g[11]。C组成为梓醇，CAS号：2415-24-9，纯度93.7%，苏州玉森新药开发有限公司生产，批号：080301，梓醇含量4.274 mg。L组成为川芎嗪，CAS号：1124-11-4，纯度：98%，购自成都瑞芬思生物科技有限公司，批号：081102，川芎嗪含量1.554 mg。CL方为4.274 mg的梓醇+1.554 mg的川芎嗪。

1.2.2 试剂与仪器 实验Morris水迷宫(上海吉量软件科技有限公司生产，型号：JLBehv-MWMG-1)，小鼠自主活动仪(成都泰盟科技有限公司生产，型号：ZZ-6型)，动物社会交互行为视频分析系统(北京天鸣宏远科技发展有限公司生产，型号：Xeye SI V1.2)。

1.3 实验方法

1.3.1 分组、造模与给药 梓醇组、川芎嗪组、CL方组小鼠每天给予相对应剂量的梓醇、川芎嗪及CL方 100 mg/kg灌胃；安理申组小鼠每天给予安理申5 mg/kg灌胃。对照组和模型组小鼠每天给予等体积的生理盐水灌胃。均每天1次，连续灌胃8周。然后进行行为测试，即Morris水迷宫(morris water maze，MWM)检测和新物体识别(new object recognition，NOR)检测[12]。

1.3.2 行为测试 ①Morris水迷宫实验：共6 d，前5 d(定位航行试验)每只小鼠每天训练3次，分别从除平台所在象限之外的另外3个象限、头朝向槽壁、置于水中60 s，如果60 s内找到平台，爬上平台并停留5～10 s，小鼠所用时间则为逃避潜伏期(escaping latency，EL)；如果60 s内仍未找到平台，则由实验者引导小鼠爬上平台、停留10 s，则将其潜伏期计为60 s，连续训练5 d，记录训练当天3次逃避潜伏期，取其平均值。第6天(空间探索试验)，撤去平台，把小鼠放入目标象限入水点，60 s内记录小鼠整个运动轨迹、在目标象限内的游泳时间、游泳距离、首次找到平台时间及穿越原平台所在位置的次数，计算小鼠在目标象限游泳时间占整个游泳时间的百分比以及在目标象限游泳距离占整个游泳距离百分比等。②新物体识别测试：准备50 cm×50 cm×40 cm的实验箱和两个大小相近但形状、颜色都不一样的物体(A和B)，在前3 d(训练期)，同一时间点把两个相同物体(A+A或B+B)对称放在实验箱中心位置上，小鼠面向笼壁放入，自由探测物体20 min；第4天(测试期)，将两个不同物体(A+B)放在上面相同位置，小鼠自由探测物体5 min，如果小鼠头部面向物品，头部与物品之间的距离≤2 cm时则表明小鼠正在探索物体，记录小鼠探测新物体和旧物体的时间，以相对识别指数(discrimination index，DI)来评价其学习记忆能力，DI=(新物体时间/总时间)×100%-(旧物体时间/总时间)×100%。

2 结 果

2.1 各组小鼠不同时间的逃避潜伏期比较 第1天，各组小鼠的逃避潜伏期之间比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。第2天，与对照组比较，模型组逃避潜伏期明显延长，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，梓醇组、川芎嗪组、CL方组及安理申组逃避潜伏期明显缩短，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。第3天至第5天，与对照组比较，模型组逃避潜伏期明显延长，差异均有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，梓醇组、川芎嗪组、CL方组及安理申组逃避潜伏期明显缩短，差异有统计学意义(P<0.01)；与梓醇组比较，CL方组逃避潜伏期明显缩短，差异有统计学意义(P<0.01)；与川芎嗪组比较，CL方组逃避潜伏期明显缩短，差异有统计学意义(P<0.05)；与安理申组比较，CL方组逃避潜伏期明显缩短，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

表1 各组小鼠不同时间逃避潜伏期比较 () 单位：s

2.2 各组小鼠空间记忆能力比较 与对照组比较，模型组目标象限出现次数减少，目标象限游程缩短，目标象限游程比下降，目标象限时间减少，目标象限时间比下降，穿台次数减少，首次穿越平台时间延长，差异均有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较，梓醇组、川芎嗪组、CL方组及安理申组目标象限出现次数增加，目标象限游程延长，目标象限游程比上升，目标象限时间增加，目标象限时间比上升，穿台次数增加，首次穿越平台时间缩短，差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。与梓醇组比较，CL方组目标象限出现次数增加，目标象限游程延长，目标象限游程比上升，目标象限时间增加，目标象限时间比上升，穿台次数增加，首次穿越平台时间缩短，差异均有统计学意义(P<0.01)。与川芎嗪组比较，CL方组目标象限出现次数增加，目标象限游程延长，目标象限游程比上升，目标象限时间增加，目标象限时间比上升，穿台次数增加，首次穿越平台时间缩短，差异均有统计学意义(P<0.05)。与安理申组比较，CL方组目标象限出现次数增加，目标象限游程延长，目标象限游程比上升，目标象限时间增加，目标象限时间比上升，穿台次数增加，首次穿越平台时间缩短，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

表2 各组小鼠空间记忆能力比较 ()

2.3 各组小鼠新物体识别测试中DI比较 与对照组比较，模型组DI明显下降，差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较，梓醇组、川芎嗪组、CL方组及安理申组DI明显上升，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。与梓醇组比较，CL方组DI明显上升，差异有统计学意义(P<0.01)。与川芎嗪组比较，CL方组DI明显上升，差异有统计学意义(P<0.05)。与安理申组比较，CL方组DI明显上升，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表3。

表3 各组小鼠新物体识别测试中DI比较 ()

3 讨 论

中药有效组分配伍不仅突破了以往主要以临床经验积累为中药研制新药的模式，也继承和发扬了中医药理论创新研究的模式，这将是中医药实现国际化、现代化的重要方向之一[5]。恒清Ⅱ号方是本课题组长期临床摸索、总结、反复验证过的防治AD有明确疗效的经验方[6-9]。熟地黄和川芎是恒清Ⅱ号方的主要组成药物。熟地黄的主要成分为梓醇，川芎的主要成分为川芎嗪。梓醇是从玄参科植物地黄新鲜或干燥块根中提取的小分子环烯醚萜类化合物，极性结构，易溶于水，分子式C15H22O10，分子量是362.33，CAS号：2415-24-9，EINECS：219-324-0。梓醇有神经保护、抗癌、抗炎、利尿、降血糖及抗肝炎病毒等作用，尤其在防治AD方面具有较好的作用，可以改善AD大鼠大脑皮质结构异常，升高大脑皮质胆碱能毒蕈碱受体M1亚型受体表达[13-14]。在血脑屏障的体外模型中，梓醇可以对β淀粉样蛋白1-42(Aβ1-42)诱导的血脑屏障破坏具有保护作用[15]。川芎嗪为中药川芎的主要有效成分，CAS号：1124-11-4；分子式：C8H12N2，分子量136.194 00。川芎嗪具有抗血小板聚集、扩张小动脉、改善微循环和脑血流等作用。由于其可通过血脑屏障，在中枢神经系统和周围神经网络均发挥着神经保护作用[16]。川芎嗪可以通过对AD大鼠海马神经元RAGE-ERK1/2-p38-NF-κB信号通路的下调作用，有效抑制神经元活性氧生成，降低β淀粉样蛋白的神经毒性，改善AD大鼠脑组织炎性，进而发挥其抗AD及神经保护作用[17]。

本研究结果显示，单用梓醇或单用川芎嗪，均可缩短APPswe/PS1dE9双转基因小鼠的逃避潜伏期、增加目标象限出现次数、延长目标象限游程、提高目标象限游程比、延长目标象限时间、提高目标象限时间比、增加穿台次数、缩短首次穿越平台时间、提高新物体识别测试中DI(P<0.05)，与安理申比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；梓醇与川芎嗪联用，即组成CL方，则可以明显缩短APPswe/PS1dE9双转基因小鼠的逃避潜伏期、增加目标象限出现次数、延长目标象限游程、提高目标象限游程比、延长目标象限时间、提高目标象限时间比、增加穿台次数、缩短首次穿越平台时间、提高新物体识别测试中DI(P<0.05)。其以上作用不仅优于梓醇、川芎嗪，而且还优于安理申。表明梓醇与川芎嗪联用起到了显著的增效作用，其作用机制则有待进一步深入探索和研究。

综上所述，CL方可以有效改善AD模型小鼠的认知障碍，其效果既优于其单一成分，也优于安理申。