川芎嗪对非小细胞肺癌细胞增殖的抑制作用及其机制

沈加熙， 詹小兰， 孙张弛

(浙江省荣军医院药剂科，浙江 嘉兴 314000)

肺癌是癌症相关死亡的常见原因，非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)约占所有肺癌病例的80%～85%，其5年生存率差[1-2]。晚期NSCLC患者的主要治疗方法是铂类双线化疗，但这些药物通常会有肾毒性、神经毒性和骨髓抑制等副作用[3]。因此，临床上迫切需要具有良好抗肿瘤活性、毒性较小的新型药物，而中药因其较化疗药物具体更少的副作用引起了越来越多的关注[4-5]。川芎嗪是中药川芎的有效成分，主要用于治疗各种脑血管和心血管疾病[6-7]。此外，已有研究证明，川芎嗪对包括肺癌、卵巢癌和肝细胞癌在内的多种上皮恶性肿瘤有着一定的疗效[5,8]。川芎嗪可能是一种潜在的预防和治疗肺癌的化学药物[8]，但其在肺癌治疗中的具体作用及机制仍然未知。因此，本研究探索了川芎嗪对NSCLC细胞系细胞活力、细胞凋亡和细胞周期的作用和机制。

1 材料

1.1 细胞 人肺上皮细胞Beas-2B、人支气管上皮细胞HBE和NSCLC细胞系A549、H460、HCC827、H1650、PC-9、H1975购自上海生物科学研究所和细胞资源中心。细胞用含10%胎牛血清(FBS)、1%青霉素/链霉素的RPMI-1640或DMEM培养基，于5% CO2、37 ℃培养箱中常规培养。

1.2 试剂与药物 川芎嗪对照品(纯度≥98%，批号1124-11)购自美国Sigma公司，溶于二甲基亚砜(DMSO，批号30072418，国药集团化学试剂有限公司)配制成100 mmol/L母液备用。四甲基噻唑蓝(MTT，批号021005)购自美国Sigma公司；一抗p-STAT3、STAT3、Bax、Bcl-2、cleaved PARP、cyclin D1、CDK-4、CDK-6、β-actin(货号9145、9139、89477、15071、5625、55506、12790、13331、3700)均购自美国Cell Signaling Technology公司；IgG-HRP二抗(货号sc-2357)购自美国Santa Cruz公司；FITC Annexin V和PI凋亡检测试剂(批号556547)购自美国BD公司。

2 方法

2.1 MTT法检测细胞活力 细胞以每孔5×103个的密度接种于96孔板中孵育过夜，弃培养基，并用不同浓度(0、6.25、12.5、25、50、100 μmol/L)的川芎嗪处理所有细胞72 h，每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，继续孵育4 h，弃上清液，加入200 μL DMSO，振荡器上孵育5 min，用酶标仪在490 nm波长处测定吸光度，实验重复3次。

2.2 平板细胞克隆实验检测细胞集落形成 将HCC827和H1650细胞以每孔1 000个的密度接种于6孔板中培养24 h，加入DMSO和川芎嗪(25、50 μmol/L)继续培养，温育2周后，PBS洗涤2次，甲醇固定15 min，结晶紫染色15 min。计数包含50个以上的细胞集落，然后拍摄可视化的细胞集落。

2.3 流式细胞术检测细胞凋亡 取HCC827和H1650细胞接种于细胞培养瓶中培养24 h，用DMSO和川芎嗪(25、50、100 μmol/L)处理细胞24 h，收集细胞，PBS洗涤2次，重悬于100 μL结合缓冲液中，加入5 μL FITC Annexin V和PI，室温孵育15 min，用400 μL结合缓冲液稀释后，通过FACS Calibur流式细胞仪分析细胞凋亡情况。

2.4 细胞周期检测 将HCC827和H1650细胞以每孔3×105个密度接种于6孔板中培养过夜，用DMSO和川芎嗪(25、50、100 μmol/L)处理24 h，收集细胞，PBS洗涤后在4 ℃的75%乙醇中固定过夜，离心弃上清，沉淀用冷PBS洗涤，重悬于含50 mg/mL PI的500 μL PBS中，4 ℃避光孵育30 min，将细胞悬液置于FACS Calibur仪上分析。

2.5 蛋白印迹法检测蛋白表达 收集细胞，裂解提取蛋白，通过BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度，通过SDS-PAGE电泳分离，并将其转移到PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭1.5 h，加入一抗cyclin D1(1∶500)、CDK4(1∶500)、CDK6(1∶500)、PARP(1∶1 000)、Bax(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)、p-STAT3(1∶1 000)于4 ℃孵育过夜，然后加入二抗(1∶5 000)孵育2 h，化学发光试剂显色，通过Amersham Imager 600系统曝光并分析。

3 结果

3.1 川芎嗪抑制NSCLC细胞增殖和细胞集落形成 如图1A所示，川芎嗪对HCC827和H1650细胞具有抑制作用，IC50值分别为20.12、22.45 μmol/L，但对非致瘤细胞系(Beas-2B和HBE)的细胞活力无明显影响，因此选择HCC827和H1650细胞用于实验。如图1B所示，HCC827和H1650细胞的集落形成均减少，说明川芎嗪对NSCLC细胞的克隆生成具有抑制作用。

3.2 川芎嗪诱导NSCLC细胞周期停滞 如图2所示，川芎嗪处理使HCC827和H1650细胞在G0/G1期以剂量依赖性方式蓄积(P<0.01)。如图3所示，与DMSO组比较，川芎嗪组下调了细胞周期调节蛋白cyclin D1、CDK4、CDK6的表达(P<0.01)。上述结果表明，川芎嗪通过减少HCC827和H1650细胞中细胞周期相关蛋白的表达，有效诱导了G0/G1期的细胞周期停滞。

3.3 川芎嗪诱导NSCLC细胞凋亡 如图4、表1所示，与DMSO组比较，川芎嗪组HCC827和H1650细胞的早期和晚期凋亡率均增加(P<0.01)。为了建立川芎嗪诱导凋亡的分子机制，通过蛋白印迹分析检测了凋亡相关蛋白的表达，包括裂解的PARP、Bax和Bcl-2。如图5所示，与DMSO组比较，川芎嗪组裂解的PARP和促凋亡因子Bax蛋白表达上调，抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表达下调(P<0.05，P<0.01)。

表1 川芎嗪对细胞凋亡率的影响

3.4 川芎嗪抑制NSCLC细胞中STAT3蛋白磷酸化水平 如图6所示，与DMSO组比较，川芎嗪剂量依赖性地降低STAT3蛋白磷酸化水平(P< 0.01)。

4 讨论

天然产物具有多样的生物活性，并被广泛研究以发掘潜在的新抗癌剂。据报道，川芎嗪作为川芎的一种生物活性成分，显示出了一定的抗癌特性，已被应用于多种类型的癌症治疗[5-8]。本研究评估了川芎嗪对2种NSCLC细胞的抑制作用，发现川芎嗪能抑制NSCLC细胞的增殖和生长，且对Beas-2B、HBE细胞没有毒性。此外，川芎嗪以剂量依赖性地诱导NSCLC细胞周期停滞，促进细胞凋亡。由此提示，川芎嗪可能是一种安全有效的抗NSCLC药物。

真核细胞以及癌细胞都经由4个不同阶段(G1期、S期、G2期和M期)，完整而有序的细胞周期对于癌细胞的生长和存活至关重要，而将细胞停滞在特定阶段可严重阻碍肿瘤的进展[9]。本研究发现，川芎嗪处理导致HCC827和H1650细胞在G0/G1期以剂量依赖性方式蓄积。细胞周期蛋白D1可以与CDK4和CDK6形成复合物，从而调节G1/S相变，并可能促进肿瘤发生[10]。本研究发现，川芎嗪下调了细胞周期调节蛋白(cyclin D1、CDK4和CDK6)的表达，提示川芎嗪通过减少HCC827和H1650细胞中细胞周期相关蛋白的表达，有效诱导了G0/G1期的细胞周期停滞。诱导细胞凋亡是大多数抗癌药物的关键[11-12]，Caspase 3及其底物聚ADP-核糖聚合酶(PARP)在转导程序性细胞死亡信号中起着核心作用。此外，Bcl-2家族成员，例如Bcl-2和Bax，也对调节癌细胞的凋亡至关重要。因此，本研究通过用膜联蛋白V-FITC和PI双重染色证实了川芎嗪对NSCLC细胞的促凋亡作用。

STAT3信号级联反应的异常激活与多种恶性肿瘤的致癌性相关[13]。此外，在超过50%的NSCLC原发性肿瘤和细胞系中发现STAT3表现出高水平的组成性激活，这表明抑制STAT3可以作为单一疗法或联合疗法用于治疗肺癌。一项临床前研究已经对几种天然来源的STAT3抑制剂(姜黄素、桦木酸和咖啡酸)的抗癌作用进行了评估[14]。然而，尚无对川芎嗪作为STAT3抑制剂在肺癌中进行应用的报道。本研究发现，川芎嗪可以降低NSCLC细胞中STAT3蛋白磷酸化水平。已有研究证明NSCLC的发生与STAT3的磷酸化表达有关[15]，提示川芎嗪可能通过抑制STAT3的磷酸化来阻碍NSCLC的发展。

综上所述，川芎嗪可能通过抑制STAT3的激活阻滞细胞周期进程并诱导NSCLC细胞凋亡，从而导致细胞活力降低和集落形成能力受损，提示川芎嗪可能作为新型有效的STAT3抑制剂，并有望成为安全有效治疗NSCLC的候选治疗剂。