血清微小核糖核酸-34a、亲吻素-1水平与胰腺癌患者化疗耐药性的相关性

李凯，陈克河，康继厚

（信阳市中心医院 消化内科，河南 信阳 464000）

手术切除后辅助化疗通常是治疗早期胰腺癌的首选方案，但由于胰腺解剖位置相对较深，多数胰腺癌患者在确诊时已处于中晚期，不宜进行手术治疗［1］。化疗是胰腺癌重要的治疗手段，虽然逐渐有新的化疗药物被研发，但胰腺癌化疗耐药的发生仍导致临床疗效不佳，病死率未见明显下降［2］。因此，分析与胰腺癌化疗耐药性相关的因素，为后续采取措施降低化疗耐药性，改善胰腺癌预后情况较为重要。微小核糖核酸（microRNA,miR）目前已被证实与肿瘤的发生发展有关，其中，miR-34a 在胰腺癌中起着重要的作用［3］。研究表明，miR-34a 可跨越细胞膜，下调靶向基因原癌基因的表达，外源性miR-34a 对胰腺癌细胞的生长有明显的抑制作用，与胰腺癌预后有关［4］。亲吻素-1（kisspeptin 1,KISS-1）在结直肠癌、膀胱癌、肝癌等多种癌症中均被证实具有抑制作用［5］。研究表明，KISS-1 与癌症的发生、发展有关，尤其与癌症的分化程度、浸润转移程度及临床分期密切相关，可作为治疗癌症的新靶点［6］。结合上述miR-34a、KISS-1 在肿瘤组织中的特点，由此推测，血清miR-34a、KISS-1 水平可能与胰腺癌患者化疗耐药性存在关联，但目前尚无研究证实。基于此，本研究分析血清miR-34a、KISS-1 水平与胰腺癌患者化疗耐药性的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

研究的实施经医院伦理委员会批准执行，前瞻选择2018 年3 月至2019 年3 月信阳市中心医院95 例胰腺癌化疗患者作为研究对象，患者与家属均对此次研究知情同意。研究对象中，男59例，女36 例；年龄43～72 岁，中位年龄51.00（45.00,55.00）岁；体质量指数18.17～25.36 kg/m2，中位体质量指数22.03（21.61,22.43）kg/m2；TNM分期［7］：Ⅲ期54 例，Ⅳ期41 例。

1.2 入选标准

纳入标准：①符合《胰腺癌诊疗规范》［8］中胰腺癌诊断标准；②接受化疗；③卡氏评分［9］＞60 分。排除标准：①入院前已接受化疗、放疗或免疫治疗；②已接受手术；③合并其他恶性肿瘤；④肝、肾脏等慢性疾病；⑤严重免疫性疾病。

1.3 方法

1.3.1 血清指标检测方法 ①化疗前，采集患者3 mL 空腹静脉血，离心机（郑州中谷机械设备，型号TGL-16）3 000 r/min 离心（半径20 cm）10 min，-80℃下保存待测，加入Trizol RNA，Trizol 法提取总RNA，经检验合格（紫外分光光度计检测RNA 总纯度1.8～2.0）后，加入0.5 μL 逆转录酶，于37℃下水浴，将总RNA 反转录为cDNA，使用实时PCR 系统（Applied Biosystems™7500）扩增，采用2-△△Ct法计算血清miR-34a 相对表达量。②化疗前，采集患者3 mL 空腹静脉血，离心机3 000 r/min 离心（半径20 cm）10 min，-70℃下保存待测，用上海恒远生化试剂有限公司提供的试剂盒，以酶联免疫吸附法测定血清KISS-1水平。

1.3.2 化疗方案 开始化疗第1 d、第8 d、第15 d，每天在30 min 内静脉滴注1 000 mg/m2吉西他滨（连云港杰瑞药业，生产批号：20171114，规格：0.2 g），开始化疗第1～14 天，口服替吉奥（日本大鹏药品工业株式会社，生产批号：20171108，规格：20 mg），40～60 mg/次，2 次/d，21 d 为1 个周期，连续治疗4 个周期。

1.3.3 化疗耐药和敏感评估方法 化疗4 个周期后随访1 个月，根据美国国家综合癌症网络（NCCN）胰腺癌临床实践指南［10］评估化疗耐药与敏感情况，无效为化疗耐药，有效为化疗敏感。疗效根据《RECIST 指南（1.1 版）》［11］评估，完全缓解（CR）：病灶完全消失，维持时间＞1 个月；部分缓解（PR）：肿瘤最长径之和较治疗前缩小≥30%，维持时间＞1 个月；疾病稳定（SD）：肿瘤最长径之和较治疗前缩小＜30%，维持时间＞1 个月；疾病进展（PD）：出现新病灶或者肿瘤最长径增大程度≥20%，有效率=CR 率+PR 率。

1.4 统计学方法

采用SPSS 24.0 软件进行数据处理。计量资料均经Shapiro-Wilk 正态性检验，偏态分布计量资料用中位数和四分位数间距［M（P25,P75）］表示，组间比较采用Mann-WhitneyU检验，计数资料用百分比表示，采用χ2检验，血清miR-34a、KISS-1水平与胰腺癌患者化疗耐药性的关系采用Logistic回归分析检验；绘制受试者工作曲线（ROC），并计算曲线下面积（AUC）值，检验血清miR-34a、KISS-1 水平预测胰腺癌患者化疗耐药的价值，AUC 值＞0.9 表示预测性能较高，＞0.7～0.9 表示有一定预测性能，0.5～0.7 表示预测性能较低，＜0.5表示无预测性能，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 耐药情况

化疗4 个周期，95 例胰腺癌患者中耐药患者有70 例，占73.68%（70/95），其中SD 患者38 例，PD 患者32 例；敏感患者有25 例，占26.32%（25/95），其中CR 患者0 例，PR 患者25 例。

2.2 基线资料和血清指标比较

两组性别、年龄、体质量指数、TNM 分级比较，差异无统计学意义（P＞0.05），耐药组血清miR-34a、KISS-1 水平低于敏感组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 两组基线资料和血清指标比较

2.3 血清miR-34a、KISS-1 水平与胰腺癌患者化疗耐药关系的Logistic 回归分析

将2.2 中比较结果显示差异有统计学意义的变量纳入作为自变量（均为连续变量），将胰腺癌患者的耐药情况作为因变量（1=耐药，0=敏感），经Logistic 回归分析检验结果显示，血清miR-34a、KISS-1 水平与胰腺癌患者化疗耐药有关，两者高表达可能是胰腺癌患者化疗耐药的保护因素（,P＜0.05）。见表2。

表2 血清miR-34a、KISS-1 水平与胰腺癌患者化疗耐药关系的Logistic 回归分析结果

2.4 血清miR-34a、KISS-1 单独及联合预测胰腺癌患者化疗耐药的价值

将胰腺癌患者的耐药情况作为状态变量（1=耐药，0=敏感），将化疗前血清miR-34a、KISS-1水平作为检验变量，绘制ROC 曲线图（见图1），结果显示，化疗前血清miR-34a、KISS-1 水平单独及联合预测胰腺癌患者化疗耐药的AUC 分别为0.753、0.770、0.775，均有一定预测价值，且当两者的cut-off 值分别取0.898、119.563 pg/mL 时，可获得最佳预测价值。见表3。

表3 血清miR-34a、KISS-1 单独及联合预测胰腺癌患者化疗耐药的价值

图1 血清miR-34a、KISS-1 单独及联合预测胰腺癌患者化疗耐药的ROC 曲线图

3 讨论

胰腺癌早期诊断存在较大的困难，多数患者在确诊时已出现其他器官侵袭或肿瘤转移，无法进行手术切除，因此，化疗治疗对于胰腺癌患者较为重要［12］。虽然新型的治疗药物或联合治疗方案已被证实可提升治疗效果，但部分患者在化疗过程中易出现耐药情况，增加肿瘤复发风险［13］。

研究显示，胰腺癌患者出现化疗耐药的频率高达78.1%［14］。本研究结果显示，化疗4 个周期，95 例胰腺癌患者中，耐药患者有70 例，占73.68%，与上述研究相符。说明，胰腺癌化疗患者耐药风险较高，因此，分析胰腺癌化疗耐药的相关因素，对提升化疗效果，改善预后较为重要。miRNA 异常表达与肿瘤的发生发展联系密切，miR-34 家族是其中的一种，具有抑癌基因p53 高度结合位点，包括miR-34a、miR-34b 和miR-34c［15］，其中，miR-34a 被证实既能作为促癌基因，诱导恶性肿瘤的发生、发展，又能作为抑癌基因，抑制恶性肿瘤的发生、发展［16］。目前，已有研究证实miR-34a 的缺失与肿瘤的发生、发展具有密切的联系［17］。而肿瘤的发展受耐药影响，由此推测，miR-34a 可能与胰腺癌化疗耐药相关。KISS-1 是一种肿瘤转移抑制基因，对癌症细胞的的增殖、迁移、侵袭等各种生物学行为具有明显的抑制作用，KISS-1 水平在多种恶性肿瘤中呈低表达［18］。研究显示，KISS-1 基因可促进人胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭［19］。由此推测，KISS-1 表达可能也与胰腺癌化疗耐药有关。本研究结果显示，耐药组血清miR-34a、KISS-1 水平低于敏感组，进一步经Logistic 回归分析检验结果显示，血清miR-34a、KISS-1 水平与胰腺癌患者化疗耐药有关，两者高表达可能是胰腺癌患者化疗耐药的保护因素。说明，血清miR-34a、KISS-1 水平可能与胰腺癌患者化疗耐药有关。分析原因为：miR-34a 能抑制肿瘤细胞的生长和侵袭，阻滞肿瘤细胞周期进展，诱导细胞凋亡，从而增加肿瘤细胞对吉西他滨的敏感性，因而缺少miR-34a 会增加肿瘤细胞的化疗耐药性［20］。miR-34a 可能通过影响耐药相关基因的表达，促进耐药株的凋亡，而miR-34a 呈低表达时，miR-34a 促进耐药株凋亡的能力降低，造成化疗耐药发生［21］。刘明明等［22］研究发现，miR-34a与癌症患者化疗耐药有关，miR-34a 能逆转非小细胞肺癌细胞对顺铂的耐药性，与本研究结果相符。KISS-1 作为肿瘤转移抑制基因，不仅能弱化细胞质内核转录因子（nuclear transcription factor-κB,NF-κB）活性，抑制NF-κB 结合基质金属蛋白酶-9，从而抑制肿瘤细胞的增殖和浸润，增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性［23］。而且，KISS-1 具有信号转导的作用，KISS-1 衍生的肽能通过G 蛋白偶联受体信号，达到信号转导，对肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭等活动进行干扰，诱导扩散的癌症细胞进入休眠状态，增加其对化疗药物的敏感性，而KISS-1不足会影响这种转导作用，增加化疗耐药风险［24］。研究表明，KISS-1 在胰腺癌诊断和预后判断中具有一定的价值［25］。最后，本研究绘制ROC 曲线图，结果显示，化疗前血清miR-34a、KISS-1 水平单独及联合预测胰腺癌患者化疗耐药的AUC 分别为0.753、0.770、0.775，均有一定预测价值。未来临床若监测到上述指标异常，可考虑补充外源miR-34a、KISS-1，以减少耐药情况发生，改善胰腺癌化疗患者预后结局。但本文未分析miR-34a、KISS-1 两者间是否互相影响，共同发挥对胰腺癌化疗耐药的作用，后续应增加研究继续探索。

综上所述，血清miR-34a、KISS-1 低表达与胰腺癌患者化疗耐药性有关，可应用于胰腺癌患者化疗耐药的预测。