裸鼠脑胶质瘤原位移植模型的建立

王卓，赵若琳，张立波

(1.南京中医药大学药学院，江苏 南京 210046；2.中国药科大学药物科学研究院，江苏 南京 211198)

脑胶质瘤(glioma) 是最常见的颅内恶性肿瘤，约占所有恶性脑肿瘤的80%,具有发病率高、复发率高、死亡率高和治愈率低等特点。目前胶质瘤的治疗手段主要包括手术、放疗和化疗为主的综合治疗[1-2]。为了研究脑胶质瘤生长、转移及治疗情况，通常采用动物肿瘤移植瘤模型和人肿瘤异体移植模型，肿瘤移植部位主要在皮下。然而，皮下移植瘤模型并不能模仿人脑胶质瘤的生长环境及发生发展过程，也不能充分反映药物的特性和疗效。另外，常见的脑胶质瘤模型通常需要处死荷瘤小鼠，这样不能实时且准确地反映肿瘤在裸鼠体内的生长状况。因此，需要建立理想的、可靠的、重复性好的脑原位胶质瘤动物模型，以研究胶质瘤颅内生长特征及治疗方法。

本文拟利用荧光素酶标记的LN229胶质瘤细胞，建立脑胶质瘤原位移植瘤动物模型，并通过动物活体成像技术观察脑胶质瘤在裸鼠体内的生长情况[3]。通过精细的术前准备和术后护理技术，保证裸鼠颅内原位接种手术成功，确保裸鼠脑胶质瘤细胞原位移植模型的成功率及存活率，为胶质瘤临床研究提供理想的动物模型[4-5]，也为验证化合物的抗脑胶质瘤作用提供有效而直观的评价方法。

1 实验材料

1.1 实验动物 SPF级BALB/c Nude小鼠，4～5周龄，雌性，9只，平均体重16～18 g，购自浙江维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号：SCXK(浙)2019-0001。小鼠饲养于中国药科大学新药安全评价研究中心[实验动物使用许可证号：SYXK(苏)2018-0019]，饲养室温度：20～26 ℃，湿度：40%～70%；饲喂SPF级大小鼠生长维持饲料,自由摄取;饮水为实验动物饮用水,饮水瓶装，自由摄取，饲料购自北京科澳协力饲料有限公司，根据垫料情况不定期更换。

1.2 药品与试剂 LN229-Luc细胞、荧光素酶底物均购自南京安米络生物技术有限公司。

1.3 主要仪器设备 小动物活体成像仪(美国PerkinElmer公司，型号：IVIS Spectrum)；二氧化碳培养箱[赛默飞世尔科技(中国)有限公司，型号：3111]；全封闭组织脱水机(Saukura，型号：VIPTM5)；半自动轮转切片机[赛默飞世尔科技(中国)有限公司，型号：美康HM340E]；全自动染色机(Saukura，型号：DRS2000)；正置生物显微镜(Olympus，型号：BX41)。

2 实验方法

2.1 LN229-Luc细胞的培养 T25培养瓶复苏培养，生长一代后，传代10 cm皿中，并加入puromycin(3 μg·mL-1) 进行培养，对数生长期的LN229-Luc细胞计数后，取5 μL(10万个细胞)进行颅内注射。

2.2 BALB/c Nude小鼠脑原位接种手术术前准备 手术前将房间进行紫外线照射消毒，手术物品提前高压灭菌后放入超净工作台，不能灭菌的物品，如碘伏、莫匹罗星、缝合线、人工石蜡、保温垫等酒精喷洒后经传递窗紫外灯消毒后使用，将手术需要的物品及调试好的立体定位仪，一起放入超净工作台，手术前打开超净工作台的紫外灯照射15 min进行消毒。

2.3 BALB/c Nude小鼠脑原位移植瘤模型的建立 收集LN229-Luc细胞，接种于裸鼠脑右侧尾状核区。手术前一天，将裸鼠禁食，手术当天，裸鼠称重麻醉后，放在保温垫上，头部固定于立体定位仪上，用碘伏对头部进行消毒后，按照矢状中线位置纵向切开皮肤，切口长度约1 cm，根据立体定位仪解剖图谱确定对应于右侧尾状核的位置：前囟点前1.0 mm，中线右1.0 mm，深度为硬膜下3.0 mm，以颅骨钻钻孔，勿损伤硬脑膜。使用10 μL微量注射器吸入5 μL含1×105LN229-Luc细胞悬液，注射细胞悬液3 min，留针2 min，钻孔用人工石蜡封闭，用5号线缝合，切口涂莫匹罗星以防术后感染。

图1 裸鼠颅内LN229-Luc细胞原位接种系统

2.4 术后护理 裸鼠苏醒后放入新更换的IVC鼠盒，并给予适当保温，每天观察小鼠状态，碘伏擦拭伤口，涂莫匹罗星，连续3 d，整个过程动作轻柔，保证充足的饮水和饲料。

2.5 检测指标

2.5.1 小动物活体成像观察 荷瘤小鼠腹腔注射荧光素底物(150 mg·kg-1)，异氟烷麻醉5 min 后，放入小动物活体成像系统进行检测。裸鼠于脑内接种后Day14、Day21、Day28、Day35、Day42进行小动物活体成像检查，监测脑内原位接种肿瘤生长情况。

2.5.2 体重变化观察 接种前称重一次，之后每周称量一次，观察体重变化。

2.5.3 BALB/c Nude小鼠原位移植瘤的病理形态学观察 裸鼠于术后第42天活体成像监测后进行安乐死，解剖取出整个脑组织于福尔马林中固定，HE染色后，进行组织病理学检查，观察肿瘤组织细胞形态及生长情况等。

3 结果

3.1 原位移植瘤模型小鼠观察 BALB/c Nude小鼠脑内原位接种LN229-Luc细胞14 d后，多数小鼠出现明显的颅内高压症状，表现为食欲不振、精神萎靡、活动减退，体重下降明显。接种21 d，裸鼠开始出现消瘦、弓背、肤色变暗，出现晚期癌症患者的恶质化现象。并于接种35 d后，小鼠开始出现死亡，至实验结束，共死亡4只，其余大部分荷瘤鼠状态欠佳。接种42 d，荧光信号达到最强，随荧光信号逐渐增强，肿瘤体积迅速增长。

3.2 体重变化 图2结果显示，BALB/c Nude小鼠脑内接种LN229-Luc细胞至21 d，体重呈现轻微的上升的趋势；随着时间延长，体重下降明显。

图2 荷瘤小鼠体重变化

3.3 活体成像结果 图3显示，通过活体成像系统观察到BALB/c Nude小鼠脑内原位接种LN229-Luc细胞第14天(Day14)具有明显的荧光信号，随着时间延长，裸鼠的荧光值逐渐增加，荧光信号逐渐增强，提示随着时间的延长，肿瘤逐渐增大。结果说明裸鼠原位移植瘤模型建立成功。荷瘤小鼠每周活体成像结果(荧光信号值)见表1。

表1 荧光信号值数据

图3 荷瘤小鼠活体成像图片

3.4 脑胶质瘤病理形态组织学观察 大体形态观察肿瘤呈椭圆形、梨形，大脑半球中部，边界轮廓稍模糊，切开后肿瘤为实质性，可见血块。镜下观察肿瘤占据右侧脑大部分(见图4A、B)，与正常脑组织分界明显(见图4C)；胶质瘤细胞生长活跃，呈假栅栏状或珊瑚状排列，密集成群，并向正常脑组织浸润生长(见图4D)。可见肿瘤细胞形态多样，呈圆形、椭圆形、柱状、多角形、不规则形状等，细胞异型性高，核大，核质深染；偶见瘤巨核细胞，核分裂象明显(见图4E)；细胞无明显排列方向，间质血管丰富，未见炎细胞浸润；肿瘤可见出血、肿瘤中心坏死，肿瘤周边脑组织细胞轻度水肿(见图4F)，未见转移。

A.脑胶质瘤整体观HE;B.脑胶质瘤整体观HE;C.脑胶质瘤边界尚清×100 HE;D.脑胶质瘤浸润性生长×100 HE;E.胶质瘤细胞×200 HE;F.肿瘤周边脑组织细胞水肿×40HE

4 结论

近年来脑胶质瘤发病率逐渐升高，脑胶质瘤的基础研究及抗肿瘤药物的临床前药效学评价通常采用皮下移植瘤模型，因为血脑屏障的缘故，该模型不能准确评价药物的抗脑瘤作用，也不能有效反映体内肿瘤的生物学进展，如血管生成、浸润和转移。随着影像技术的发展，原位移植瘤模型已逐渐用于评价能透过血脑屏障的抗肿瘤药物。在本研究中，荷瘤小鼠通过小动物活体成像实时监测肿瘤生长情况。小动物活体成像技术是近期发展起来的一种新型影像检测技术，是检测动物体内分子及细胞事件的强有力手段。利用生物发光成像(BLI) 可以对活体病灶的大小进行无损伤直观准确检测[6]，具有极高的检测灵敏度。生物发光优点在于安全、实时、准确，为研究肿瘤的发生、发展过程和抗肿瘤药效动物实验提供了科学准确的依据[7]。因此被广泛用于肿瘤转移、基因治疗、干细胞示踪等相关研究[8]。

本实验的优势在于在已有的脑胶质瘤原位模型的构建方法的基础上，对接种部位的坐标定位及术后护理进行改进和优化。将LN229-Luc细胞接种于BALB/c Nude小鼠大脑右侧尾状核，坐标为前囟点前1.0 mm，中线右1.0 mm，深度为硬膜下3.0 mm，选择此注射点目的是保证将LN229-Luc细胞准确的移植到尾状核内，从而保证肿瘤的生长，本研究中9只裸鼠造模后全部成瘤，成功率100%；结合精细的术后护理，存活率100%。颅内肿瘤生长稳定，荷瘤裸鼠体重在早期呈现轻微的上升的趋势，但是裸鼠在接种21 d后，体重下降明显；同时，从小动物活体成像结果看出，裸鼠接种21 d后，肿瘤的体积开始迅速增长。HE染色可观察到胶质瘤呈假栅栏状或珊瑚状排列，密集成群，并向正常脑组织浸润生长，胶质瘤瘤细胞生长活跃，异型性明显，其生长特性和病理特性与人脑胶质瘤相似。本实验9只裸鼠均于接种LN229-Luc细胞后14 d即可见脑胶质瘤形成，随后肿瘤生长明显加快，21 d时，裸鼠出现消瘦、弓背、激惹、癫痫等神经症状，35 d后开始陆续出现死亡。

本实验建立的裸鼠脑胶质瘤原位移植模型较已有模型小鼠存活率和成瘤率高，实验重复性好，是一种研究胶质瘤的发病机制、探索各种实验性治疗方法以及抗肿瘤药的药效学评价理想的动物模型。