高效液相色谱法测定杂质1-羟基苯并三唑的含量

2022-01-07陈玉青熊彩云蒋金霞兰公剑

浙江化工 2021年12期

陈玉青，熊彩云，蒋金霞，兰公剑

（南京正大天晴制药有限公司，江苏南京 210046）

N-2-[ (二乙基氨基)乙基]-5-甲酰基-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺（以下简称起始物料1）为常见化工原料，可用于替尼类药物的合成，在其合成过程中可能引入杂质1-羟基苯并三唑，进一步传导至原料及其制剂中，对患者造成伤害，其含量需要进行控制以保证药品的安全性。

近年来，基因毒性杂质引起越来越多的关注，杂质在化合物合成过程中是难以避免的，且种类多、分类困难。为了区分普通杂质和基因毒性杂质，相关法规和指导原则普遍采用了“警示结构”的方法，具有警示结构的化合物通常被认为具有潜在基因毒性[1]。杂质1-羟基苯并三唑具有警示结构[2]，需要按照基因毒性杂质控制策略进行研究，根据指导原则，通常认为成人每日摄入杂质1-羟基苯并三唑的量低于1.5 μg 时，诱发癌变的风险是可以接受的，该制剂最大日服用量为117 mg，计算并制定杂质1-羟基苯并三唑在起始物料1 中的限度为0.00125%。目前关于杂质1-羟基苯并三唑的检测方法无相关文献报道，根据杂质结构特点新建了HPLC 方法检测该杂质，起始物料1 及杂质1-羟基苯并三唑结构式见图1。

图1 起始物料1 及杂质结构式

1 仪器与试剂

1.1 仪器

高效液相色谱仪，型号：Agilent 1260，安捷伦；电子天平，型号：XP-205DR，梅特勒托利多。

1.2 试剂

磷酸（美国ROE Scientific 公司）、乙腈（美国TEDIA 公司），均为HPLC 级。

杂质1-羟基苯并三唑对照品，批号：20140806，苏州昊帆生物股份有限公司；起始物料1 供试品，批号：YY18051001，苏州海宇生物科技有限公司。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：YMC Pack ODS-A，250 mm×4.6 mm，5 μm；流动相：0.1%磷酸-乙腈（85:15）；检测波长：210 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱温：20 ℃。

2.2 溶液配制

2.2.1 空白溶剂

0.1%磷酸-乙腈（85:15）。

2.2.2 供试品溶液

取供试品适量，加溶剂溶解并稀释成浓度为10 mg/mL 的溶液，摇匀。

2.2.3 对照品贮备液

精密量取杂质1-羟基苯并三唑对照品适量，加溶剂溶解并稀释制成浓度为0.5 mg/mL的溶液，摇匀。

2.2.4 对照品溶液

精密量取对照品贮备液适量，用溶剂稀释制成浓度约为0.1 μg/mL的溶液。

2.2.5 系统适用性溶液

取供试品和对照品贮备液适量，加溶剂溶解并稀释制成每毫升约含起始物料1 10 mg、杂质1-羟基苯并三唑0.5 mg 的混合溶液，摇匀。

2.3 专属性

分别精密量取空白溶剂、系统适用性溶液、对照品溶液和供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果表明：空白溶剂和供试品溶液中其他杂质不干扰杂质1-羟基苯并三唑的测定，供试品溶液中杂质1-羟基苯并三唑未检出，方法专属性良好，结果见图2。

图2 专属性试验图谱

2.4 检测下限与定量下限

取对照品溶液逐级稀释，信噪比不小于10的溶液作为定量下限溶液。杂质1-羟基苯并三唑的定量下限为0.05 μg·mL-1（相当于限度浓度50%），连续进样6 次，其峰面积RSD 为3.6%，表明定量下限精密度良好。

取对照品溶液逐级稀释，信噪比不小于3 的溶液作为检测下限溶液，杂质1-羟基苯并三唑的检测下限为0.015 μg·mL-1（相当于限度浓度15%），表明本方法灵敏度良好，满足检测需求。

2.5 线性范围

精密移取2.2 项下对照品贮备液适量，制成系列浓度对照品溶液。精密量取上述溶液各10 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。以浓度（μg·mL-1）为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归。杂质1-羟基苯并三唑的线性方程为：y=80818x-5.7233（r=0.9999），结果表明杂质1-羟基苯并三唑浓度在一定范围内，与其峰面积线性关系良好。

2.6 进样精密度

精密量取限度浓度对照溶液10 μL，注入液相色谱仪，连续进样6 针，记录色谱图，杂质1-羟基苯并三唑峰面积的RSD 为4.9%，表明仪器进样精密度良好。

2.7 准确度与重复性

准确度是以杂质的回收率来表示，通过向供试品溶液中加入限度浓度为50%、100%、150%三个不同浓度水平的杂质溶液计算杂质的回收率；同时采用9 份样品的测定结果进行重复性评价。不同浓度水平的加标供试品溶液中杂质1-羟基苯并三唑回收率在80%～120%之间，平均回收率分别为90.7%（RSD 为7.0%），表明本方法的准确度和重复性良好。