芍药苷对脂多糖诱导SH-SY5Y细胞损伤的影响

宋 歌 高 伟 冀亚茹 李 娜 郭婷婷 晏婷婷 徐晓燕

山东第一医科大学（山东省医学科学院）药理学研究所，山东泰安 271016

芍药苷（paeoniflorin，PF）是中草药芍药的主要有效成分，具有显著的镇痛、镇静、降血糖、免疫调节、解热解痉、利尿以及护肝作用，并且具有扩张血管、抗血栓、抗高血脂、抗炎、抗肿瘤、抗溃疡和抗过敏、抗抑郁、抗自由基损伤等多种生物学效应［1-4］。近年来，PF对神经系统的保护作用越来越受关注，研究显示，PF可以改善神经突触可塑性损伤，对脑缺血损伤、阿尔茨海默病等都有一定的治疗作用［5-9］。SH-SY5Y细胞来源于人的神经母细胞瘤细胞系SK2N2SH，具有神经突触样的细胞质突起，广泛运用于神经退行性疾病的发病机制研究［10-12］。本实验通过CCK-8法和蛋白质印迹法研究不同浓度的芍药苷对脂多糖诱导的SH-SY5Y细胞损伤的保护作用及其对相关蛋白质表达的影响，为进一步研究芍药苷的神经保护作用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验仪器与试剂

CO2培养箱（Thermo公司）；酶标仪（Infinife M200 pro型号TECAN公司）；美国bio-RAD Powerpac Basic电泳仪（伯乐）；倒置显微镜（OLYMPUS-1＊71）。DMEM完全高糖培养液（江苏凯基生物科技股份有限公司）。脂多糖（SIGMA公司）；芍药苷［peoniflorn，PF，南京普怡生物科技有限公司（批号SYG20150522），质量分数为98.76%（HPLC测定）］；BCA蛋白浓度测定试剂盒（北京Solarbio公司）；NLRP3、Bax、Bcl2、β-actin（一抗，美国abcom公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养与实验分组 SH-SY5Y细胞用DMEM高糖培养基（含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L链霉素）于5%CO2培养箱中37℃培养。随机分为（1）正常对照（control）组：培养液中常规培养；（2）LPS组：培养液中加入终浓度为0.1μg/μL LPS；（3）芍药苷组：培养液中先加入PF（100、200和400μg/mL）培养24 h，再加入0.1μg/μL LPS；继续培养24 h收集细胞。

1.2.2 细胞活力和LDH测定 将细胞按4×10³/孔接种于96孔板上，经上述分组处理后进行培养，培养结束后，每组每孔加入CCK-8溶液10μL，在37℃继续孵育2 h，多功能酶标仪于450 nm处测定光密度（optical density，OD）值。以正常对照组细胞活力为100%，其余各组细胞活力以其OD值占对照组OD值的百分比表示，计算各组细胞存活率，并进一步计算脂多糖对各组细胞增殖的抑制率。

1.2.3 Western blot法分析NLRP3、Bax、Bcl-2在各组细胞中的表达 将细胞按6×10³/孔接种于6孔板上，经上述分组处理后进行培养，培养结束后，提取各组细胞总蛋白，调整各组蛋白浓度，将等量各组蛋白经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后电转至PVDF膜上，经8%奶粉液封闭4 h。将封闭好的相应PVDF膜条正面朝上分别放入经封闭液稀释好的一抗（NLRP3、Bax、Bcl2、β-actin）中4℃孵育过夜，第二天取出后室温摇晃2 h。洗膜后与辣根过氧化物酶标记的相应二抗室温孵育2 h。TBST洗膜后，抗原-抗体复合物用ECL法显示，应用化学发光成像仪进行图像采集。采用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件（Media Cybernetics，MD，USA）分析蛋白条带积分光密度（integrated optical density，IOD）值，以靶蛋白IOD值/β-actin IOD值的比值反映靶蛋白相对水平。

1.3 统计学分析

实验数据以均数±标准差（±s）表示，使用SPSS20.0进行统计分析，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 芍药苷对脂多糖诱导的SH-SY5Y细胞损伤的影响

对照组SH-SY5Y细胞生长良好，树枝状轴突明显，细胞生长为椭圆形或梭形，细胞透亮；LPS组的细胞有损伤且细胞密度变小，细胞的间隙变大，细胞增殖受到抑制；LPS+PF组的细胞生长较好，密度相对较大，细胞增殖受抑制减轻。细胞活力检测实验结果显示芍药苷组细胞抑制率明显降低，P＜0.05，差异具有统计学意义。具体见表1。

表1 芍药苷对LPS诱导的SH-SY5Y细胞损伤的影响

2.2 芍药苷对NLRP3炎性小体表达的影响

与对照组相比，模型组细胞NLRP3表达增加，而芍药苷组的细胞NLRP3降低，差异具有统计学意义（P＜0.05），提示芍药苷对细胞的保护作用可能与降低NLRP3的表达和抑制炎症反应有关。结果见图1，表2。

表2 芍药苷对NLRP3炎性小体表达的影响

图1 芍药苷对NLRP3炎性小体表达的影响

2.3 芍药苷对Bax及Bcl-2凋亡相关蛋白表达的影响

与对照组相比，模型组Bax蛋白表达升高，Bcl-2蛋白表达降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。与模型组相比，芍药苷组Bax蛋白表达降低、Bcl-2蛋白表达升高，且具有一定剂量依赖性，差异有统计学意义（P＜0.05），提示芍药苷可以影响凋亡相关蛋白的表达。结果见图2，表3。

表3 芍药苷对BAX及Bcl-2凋亡相关蛋白表达的影响

图2 芍药苷对BAX及Bcl-2凋亡相关蛋白表达的影响

3 讨论

脂多糖中脂质A是细菌内毒素活性的根源，可以产生内毒素，对细胞产生毒性，使细胞增殖受抑制，甚至凋亡［13-14］。本实验前期采用MTT法摸索了LPS诱导SH-SY5Y细胞损伤的最佳浓度为0.1μg/μL，损伤时间为24 h。在此基础上进行芍药苷的预保护，结果显示，各浓度芍药苷可明显减轻LPS造成的SHSY5Y细胞损伤，细胞活力受抑制的程度明显减轻，并存在一定的剂量依赖性。

NLRP3炎症小体是一种大分子多蛋白复合体，能被多种病原相关的分子进行活化，对发挥固有免疫系统的功能具有重要的作用。NLRP3可以被脂多糖刺激活化，使细胞内产生大量的炎症介质，使机体产生炎症反应，从而促进炎症性肠病和阿尔茨海默病等疾病的发生［15-18］。目前研究表明，NLRP3炎症小体可能成为多种炎症疾病的核心及防治的新靶点。本实验发现脂多糖可使NLRP3的表达增加，芍药苷可使NLRP3的表达降低，提示芍药苷对细胞的保护作用可能与降低NLRP3的表达和抑制炎症反应有关。

研究表明，细胞凋亡与很多神经性疾病的发生发展相关，其中Bcl-2的发现打开了基因调控细胞凋亡的先河，其在线粒体膜、内质网和核膜上编码26 kD的蛋白，通过过度表达来有效抑制细胞凋亡［19］。Bax是一类与Bcl-2作用相反的促凋亡蛋白，属于Bcl家族，它的表达能促进细胞凋亡。有研究显示，细胞增殖及凋亡与Bax表达有关［20］。所以，通过调控Bcl-2和Bax的表达水平，能够调控细胞凋亡水平，而Bcl-2和Bax也成为了评价细胞凋亡的关键指标。本实验结果显示，脂多糖组Bcl-2表达降低，Bax表达增加，而芍药苷组Bcl-2表达增加，Bax表达降低，提示芍药苷对脂多糖诱导损伤的保护作用，可能与其上调Bcl-2表达及下调Bax表达，抑制细胞凋亡相关。

综上所述，芍药苷可通过抑制NLRP3炎症小体的表达，减轻炎症反应；同时增加抗凋亡蛋白Bcl-2表达、降低促凋亡蛋白Bax表达，抑制脂多糖诱导的SH-SY5Y细胞凋亡，增加细胞存活率。本研究为进一步深入阐明芍药苷的神经细胞保护作用机制提供了新的实验依据。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突