膨大剂对白肉枇杷果实发育中有机酸代谢的影响

吴敏兰，黄春华，陈进树，王美容，吴锦程, 3

(1.漳州城市职业学院 园林园艺系，福建 漳州 363000；2.莆田学院 环境与生物工程学院，福建 莆田 351100; 3.枇杷种质资源创新与利用福建省高校重点实验室，福建 莆田 351100)

依据果肉颜色，枇杷可分为黄肉枇杷和白肉枇杷两大类.“白梨”(EriobotryajaponicaLindl. cv. Baili)为白肉枇杷的一个品种，果实营养丰富、甜度高、口感好[1]，但“白梨”枇杷果实偏小，影响其商品价值.膨大剂(fruit-expander)是一种植物生长调节剂，促进植物细胞的生长与分裂.在农业生产上，使用膨大剂可以促进果实提早成熟、增大果径、提高产量等.蒋小平等[2]研究发现，在猕猴桃上使用膨大剂可增大果实并提高其市场需求量，但过度使用膨大剂将导致果实品质与挂果数的下降.近年来，膨大剂被应用于枇杷生产.因白肉枇杷果型普遍小于黄肉枇杷，果农期望通过喷膨大剂以改善白肉枇杷果型小的缺点，但同样也存在果实品质下降的现象.

有机酸是形成枇杷果实品质的主要成分，枇杷果实以苹果酸为主要有机酸，其次还含有柠檬酸、乳酸、酒石酸、丙酮酸等有机酸[3-4].果实有机酸代谢研究已有不少的相关报道.如Notton等[5]对油梨果实的研究表明，苹果酸的合成途径主要与磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC，EC 4.1.1.31)、苹果酸脱氢酶(NAD-MDH，EC 1.1.1.37)密切相关，且苹果酸与OAA进入TCA循环生成柠檬酸，王鹏飞等[6]研究发现NADP-苹果酸酶(NADP- ME，EC 1.1.1.40)、NAD-MDH及PEPC均与苹果酸的合成与分解有关.杨滢滢等[7]研究“纽荷尔”脐橙果实提出柠檬酸的合成与PEPC、CS有关.龚荣高等[8]研究显示，脐橙果实中柠檬酸的积累与NAD-异柠檬酸脱氢酶(NAD-IDH，EC.1.1.1.41)活性呈现负相关性.文涛等[9]研究认为，PEPC和柠檬酸合成酶(CS，EC 4.1.3.7)随着脐橙果实的生长发育而逐渐增加，加速了合成柠檬酸的进程，相反，抑制柠檬酸合酶的活性可达到降低有机酸积累的效果.本研究以 “白梨”枇杷为试验材料，分析膨大剂对果实发育过程中有机酸代谢的影响，以期探讨膨大剂处理对枇杷果实品质影响的生理机制.

1 材料与方法

1.1 材料及处理

以生长正常、长势相对一致、本砧高接换种的15年生白肉枇杷“白梨”(EriobotryajaponicaLindl. cv. Baili)为试材(福建省莆田市常太镇枇杷产区提供)，按枇杷生产进行常规的水肥、病虫害、疏花、疏果等管理.将供试枇杷树分为2组，以花后100 d采用0.01‰氯吡脲蘸枇杷幼果为处理组，以H2O处理为对照(CK)，每个处理5株，重复3次，共15株.自花后100 d起每隔5 d取样1次，共取5次，取样后当日运回福建省枇杷种质资源创新与利用高校重点实验室，削皮去核后迅速置于装有液氮的保温杯中，处理后再用塑封袋分批装袋并做好标记，保存于-80 ℃冰箱中，待测相关指标.

1.2 主要试剂与仪器

4-羟乙基哌嗪乙磺酸(Hepes)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、还原性辅酶Ⅰ(NADH)、异柠檬酸三钠盐、Tris碱、还原型谷胱甘肽(GSH)、草酰乙酸(OAA)、5,5′-二硫硝基苯甲酸(DTNB)、苹果酸、无水硫酸锰、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)、碳酸氢钾、氯化镁、磷酸烯醇式丙酮酸单钾盐、乙酰辅酶A、蔗糖、异抗坏血酸、X-100曲拉通等试剂均为分析纯.

MDF-U4086S型超低温冰箱，5415R型Eppendorf冷冻离心机，上海美谱达V-1800型可见分光光度计，Eppendorf移液枪，pHS-25型酸度计，超纯水系统(Sartorius)，SIM-F140制冰机(SANYO)，超低温冰箱(SANYO，MDF-U4086S型)等.

1.3 测定项目与方法

1.3.1 苹果酸、柠檬酸(CA)含量的测定 称取0.1 g枇杷果肉在1 mL提取液中进行冰浴匀浆，经4 ℃下11 000gmin-1离心10 min，取上清液(置冰上)参照苹果酸、柠檬酸(CA)检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)提供的分光光度法测定枇杷果实苹果酸、柠檬酸的含量.

1.3.2 酶活性的测定 NADP-IDH、NAD-MDH、NADP-ME、PEPC、CS酶液提取及活性测定参照郭润姿[10]的方法稍作修改.酶促反应体系为3 mL，以反应体系不加酶液进行调零，反应底物加入后应立即混匀并测定反应3 min前后的吸光度差值.酶活性以1 min吸光度变化0.01为一个活力单位，酶活性以umin-1g-1表示.

1.4 数据分析

采用Excel 2003和SAS 9.0统计软件进行差异显著性检验并作图，结果均为3次重复的平均值.

2 结果与分析

2.1 膨大剂对枇杷果实发育过程中苹果酸和柠檬酸含量的影响

苹果酸和柠檬酸是枇杷果实主要的有机酸，因而对枇杷果实品质产生重要的影响(图1～2).

图1 枇杷果实发育过程中苹果酸含量的变化 图2 “白梨”枇杷果实发育过程中柠檬酸含量变化Fig.1 The changes of malic acid content during developoment of loquat fruit Fig.2 Changes of citric acid content during fruit developoment of Eriobotrya japonica Lindl. cv. Baili

由图1可见,在枇杷果实发育过程中,果实苹果酸含量均呈“升-降”的变化规律,其中在花后100～115 d,果实苹果酸快速积累,并于115 d达到峰值,经膨大剂处理的枇杷果实苹果酸含量略高于对照;而在花后115～120 d，果实的苹果酸含量急剧下降,并于花后120 d(即果实成熟期)达到最低值,经膨大剂处理的果实苹果酸含量低于对照,但两者差异无统计学意义(P>0.05).由图2可知,果实发育前期开始积累柠檬酸,并于花后110 d达到峰值;随着果实发育趋向成熟,柠檬酸含量呈急剧下降的趋势.花后100～110 d发育阶段的果实,对照组与膨大剂处理的果实柠檬酸含量差异无统计学意义(P>0.05);而在花后110～115 d经膨大剂处理的果实柠檬酸含量低于对照组,且差异有统计学意义(P<0.05).结果表明,经膨大剂处理的果实苹果酸、柠檬酸低于对照组,膨大剂处理抑制了枇杷果实苹果酸、柠檬酸的积累.

2.2 膨大剂对枇杷果实发育过程中PEPC和CS酶活性的影响

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)为胞质酶，催化PEPβ-羧化生成OAA和无机磷，OAA在NAD-苹果酸脱氢酶(NAD-MDH)催化下还原成苹果酸，PEPC是果实苹果酸合成的关键酶.从图3可知，在枇杷果实发育过程中，果实PEPC的活性呈现“升-降-升”的变化趋势，即在花后100～110 d果实PEPC活性呈快速上升，并于花后110 d时达峰值，110～115 d则呈下降趋势，115～120 d转而呈上升趋势.花后105～110 d果实PEPC酶活性与对照相近，差异无统计学意义(P>0.05)；而在花后110～120 d则低于对照，两者差异有统计学意义(P<0.05).结果表明，膨大剂处理抑制了果实PEPC酶活性，减少果实苹果酸含量的积累.

图3 “白梨”枇杷果实发育过程中PEPC活性的变化 图4 “白梨”枇杷果实发育过程中CS活性的变化Fig.3 Changes of citric acid content during fruit of Eriobotrya japonica Baililindl. cv. Baili Fig.4 Changes of CS activity during fruit developoment developoment of Eriobotrya japonica Lindl. cv. Baili

柠檬酸合成酶(CS)催化OAA与Ac-CoA缩合为柠檬酸，是果实柠檬酸合成的关键酶[7].由图4可知，在果实发育进程中，CS酶活性呈“降-升-降”的变化趋势，经膨大剂处理的果实CS酶活性低于对照，其中在100～105 d显著低于对照(P<0.01)；在花后105～110 d，经膨大剂处理的果实CS酶活性虽低于对照，但差异并不显著；而在花后110～120 d，经膨大剂处理的果实CS酶活性低于对照，差异有统计学意义(P<0.05).结果表明，膨大剂抑制了果实CS酶活性，从而阻碍了果肉细胞柠檬酸的积累.

2.3 膨大剂对枇杷果实发育过程中NADP-IDH和NADP-ME酶活性的影响

异柠檬酸脱氢酶(NADP-IDH)参与柠檬酸的分解，而NADP-苹果酸酶(NADP-ME)与苹果酸的降解有关，该2种酶在减少果实有机酸中起重要作用[11-12].由图5可知，在果实发育过程中，NADP-IDH酶活性表现为“降-升-降”的动态变化;果实花后100～105 d，NADP-IDH活性呈快速下降;而在花后105～120 d虽呈现“升-降”的变化趋势，但变化幅度较为平缓.经膨大剂处理的果实NADP-IDH酶活性在花后100～105 d高于对照，而花后105～120 d两者差异无统计学意义(P>0.05).经相关性分析，NADP-IDH酶活性与柠檬酸含量呈负相关.可见，膨大剂处理提高了果实NADP-IDH酶活性，促进了柠檬酸的降解，抑制了柠檬酸的积累.

NADP-ME酶活性在果实发育过程中与NADP-IDH酶呈“降-升-降”相同的变化规律，总体上呈现下降的趋势，但两者活性变化的转折点存在差异.经膨大剂处理的果实NADP-ME酶活性高于对照，两者在花后105～115 d差异有统计学意义(P<0.05)(图6)，果实NADP-ME酶活性与苹果酸含量呈负相关.结果表明，膨大剂处理提高了NADP-ME酶活性，促进苹果酸的分解，可能是导致果实苹果酸含量较低的原因之一.

图5 “白梨”枇杷果实发育过程中NADP-IDH活性变化 图6 “白梨”枇杷果实发育过程中NADP-ME活性变化Fig.5 Changes of NADP-IDH activity during fruit developoment of Eriobotrya japonica Lindl. cv. Baili Fig.6 Changes of NADP-ME activity during fruit developoment of Eriobotrya japonica Lindl. cv. Baili

2.4 膨大剂对枇杷果实发育过程中NAD-MDH酶活性的影响

图7 “白梨”枇杷果实发育过程中NAD-MDH活性变化Fig.7 Changes of NAD-MDH activity during fruit developoment of Eriobotrya japonica Lindl. cv. Baili

NAD-苹果酸脱氢酶(NAD-MDH)是细胞质中苹果酸合成的重要酶，通过PEPC产生OAA，在NAD-MDH的催化下转变成苹果酸.在发育过程中枇杷果实NAD-MDH活性呈现现“升-降-升”的变化规律，花后100～105 d呈上升趋势，花后105～115 d急剧下降，花后115～120 d即果实成熟前再次上升(图7).膨大剂处理的果实NAD-MDH活性总体上低于对照，差异有统计学意义(P<0.05).经相关性分析，果实NAD-MDH酶活性与苹果酸含量呈正相关.结果显示，膨大剂处理抑制了枇杷果实NAD-MDH酶活性，可能在一定程度上阻碍了苹果酸的生成.

3 讨论

亚洲人喜欢偏甜的口味，而欧洲人喜欢偏酸的口味，尽管不同人种的口味偏好不同，但酸和糖始终是构成食品风味品质的两大重要因素，枇杷果实风味品质也不例外.枇杷为苹果酸型果实，苹果酸占果实中有机酸含量的56%～92%，还含有柠檬酸、酒石酸和顺乌头酸等[4,13].本研究发现，膨大剂处理阻碍了枇杷果实苹果酸、柠檬酸的积累，使有机酸含量低于未经膨大剂处理的果实，果实有机酸含量的降低可能是枇杷生产上使用膨大剂导致果实风味变淡的重要原因之一.试验还发现苹果酸、柠檬酸的积累主要集中在枇杷果实发育的前中期，而进入果实发育后期和成熟期则积累水平降低，这与其他相关研究结果相一致[14-15].

PEPC、NAD-MDH和NADP-ME是果实发育过程中苹果酸代谢的关键酶，参与调控果实苹果酸的形成与积累，其中PEPC和NAD-MDH酶是苹果酸合成的关键酶，而NADP-ME酶则促进苹果酸的降解[16-17].王鹏飞等[6]研究发现欧李果实发育过程中，苹果酸含量的变化与PEPC、NAD-MDH及NADP-ME活性密切相关，它们与果实苹果酸的合成与分解有关.王小红等[18]在“蜂糖李”的研究中发现，苹果酸的积累主要发生在果实发育的前中期，PEPC和NAD-MDH酶活性与果实苹果酸积累呈正相关，其中以PEPC酶起主要作用，而NADP-ME酶活性与苹果酸积累则呈负相关.本研究表明，经膨大剂处理的果实在其发育后期和成熟期PEPC、NAD- MDH低于对照，而NADP-ME酶活性却高于对照.不难看出，一方面果实苹果酸合成受阻，另一方面果实苹果酸分解被加强，促使果实苹果酸积累的下降.枇杷作为苹果酸型果实，果实苹果酸积累水平的降低可能是施用膨大剂导致风味变淡的重要因素. 柑橘类果实为柠檬酸型果实，有关果实柠檬酸代谢的研究在脐橙上有较多的相关报道.杨滢滢等[7]研究发现PEPC酶参与了“纽荷尔”脐橙果实柠檬酸的合成.龚荣高等[8]报道了脐橙果实柠檬酸的积累与NADP-IDH酶活性呈负相关性.文涛等[9]研究结果表明，PEPC和CS酶活性的上升则促进脐橙果实柠檬酸的合成，而抑制PEPC和CS酶活性则降低果实有机酸的积累.Sadlka等[12]发现，柠檬果实发育早期柠檬酸含量的快速增加与NADP-IDH活性降低以及CS酶活性的上升密切相关.陈美霞等[15]研究表明CS酶活性与杏果实柠檬酸含量呈正相关.本试验结果显示：经膨大剂处理的枇杷果实PEPC和CS酶活性低于对照组，NADP-IDH酶活性虽在果实成熟前均高于对照组，但差异并不显著，表明膨大剂对枇杷果实PEPC和CS酶活性具有抑制作用，而对NADP-IDH酶活性具有激活作用但并不明显.可见，膨大剂处理通过抑制PEPC和CS酶活性减少了柠檬酸的合成，而NADP-IDH酶活性上升促进柠檬酸的降解，但对果实柠檬酸含量的积累水平影响较小.因此，膨大剂处理减少了果实柠檬酸的积累主要通过抑制PEPC和CS酶活性起调控作用，而NADP-IDH酶作用不明显.

4 结论

膨大剂处理降低了枇杷果实中PEPC、CS和NAD-MDH酶活性，提高了NAD-MDH、NADP-ME及NADP-IDH酶的活性，抑制了PEPC、CS和NAD-MDH等苹果酸和柠檬酸合成相关酶的活性，促进了NAD-MDH、NADP-ME及NADP-IDH等苹果酸和柠檬酸降解相关酶的活性，可能是膨大剂处理导致果实苹果酸和柠檬酸含量降低的原因.另一方面，可溶性固形物也是构成枇杷果实品质的关键因素之一.苹果酸和柠檬酸含量的降低是否是膨大剂处理导致果实品质下降的主要原因有待进一步研究.