高同型半胱氨酸血症相关的MTHFR C677T的遗传多态性与缺血性脑卒中的关系

崔晓蝶 林 平 黄玉冰 白 鹰△

1）大连大学附属新华医院，辽宁大连 116621 2）大连大学，辽宁大连 116022

脑卒中是目前全世界面临的医学难题。据流行病学研究报道，每年新增脑卒中病例高达250万，脑卒中相关病因超过100万，脑卒中分为缺血性脑卒中（ischemic stroke，IS）和出血性脑卒中，其中缺血性脑卒中是最常见的脑卒中类型，占所有脑卒中事件的80%以上［1-3］。虽然缺血性脑卒中已被全球关注和研究多年，但缺血性脑卒中具体的病因并不清楚，目前认为其致病因素并不是单一的，而是多种危险因素相互作用的结果，其中遗传和环境因素受到关注［4-6］。目前缺血性脑卒中的治疗方法有限，改变获得性危险因素进行一级预防以降低缺血性脑卒中的病死率和发病率显得尤为重要。对高血压、糖尿病、高脂血症、吸烟、酗酒、心脏病等缺血性脑卒中的传统危险因素进行适当的处理，虽然对降低缺血性脑卒中发病率起到部分作用，但作用有限，目前来看并不能明显降低卒中发生率［7-9］。近年来大量相关研究集中在遗传变异与缺血性脑卒中易感性之间的关系上。

亚甲基四氢叶酸还原酶参与氨基酸和嘌呤生物合成途径，是血同型半胱氨酸代谢过程中所必需的还原酶，在同型半胱氨酸与蛋氨酸的代谢循环过程中起催化5，10-亚甲基四氢叶酸的作用，使其转化为生成蛋氨酸所必需的5-甲基四氢叶酸［12-13］。亚甲基四氢叶酸还原酶基因（methylenetetrahydrofolate reductase gene，MTHFR）定位于染色体位置1p36.3［10-11］，该基因的C677T位点具有多态性，MTHFR基因677核苷酸C-T 替换的常见突变（rs1801133，C667T），该突变与酶活性降低有关，从而影响5-甲基四氢叶酸的生成，阻碍同型半胱氨酸的再甲基化，导致体内同型半胱氨酸升高［14-15］。研究报道，高同型半胱氨酸血症（hyperhomocysteinemia）是多种疾病的间接或直接危险因素，近年来大量研究探讨了高同型半胱氨酸与缺血性脑卒中之间的关系［16-19］，并已确定高同型半胱氨酸血症是缺血性脑卒中独立危险因素之一［5］。虽然与同型半胱氨酸代谢密切相关的MTHFR C677T变异被提出可能与血浆同型半胱氨酸水平之间有相互协调作用，导致缺血性脑卒中的患病风险增高，但目前并没有大家一致认同的准确结论［16，20-22］。这些冲突的结果可能是由于样本量小、民族多、缺乏对生活方式的考虑。本研究探讨MTHFR 基因多态性在IS 中的作用，并将这些结果与IS患者的血浆Hcy水平进行关联分析。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2019-09-12—2021-09-15于大连大学附属新华医院神经内一科就诊的84例IS患者为实验组。所有受试者为新诊断的缺血性脑卒中患者，并经严格的计算机断层扫描（CT）或磁共振（MR）脑成像证实。患者被证实有脑出血或其他伴随的严重内科疾病，如恶性肿瘤、严重肝肾功能障碍、恶性贫血和自身免疫性疾病，则被排除在外。另选100 例无卒中史的健康体检者为对照组。所有参与研究者均已签署知情同意书，研究方案由大连大学附属新华医院伦理委员会审核批准。

1.2 方法 取患者空腹血液，离心留上层血清。使用半胱氨酸含量检测试剂盒，取0.2 mL 血清加试剂盒自配现成提取液0.3 mL，充分混匀，提前将离心机预冷，离心，取血清，待测。分光光度计预热，调零，然后将标准品加入0.826 mL 蒸馏水得到100 μmol/mL 的标准液，然后加水按不同浓度梯度稀释标准溶液。取出18个实验管分为6个测定管、6个标准管、6个空白管，3个一组。不同浓度标准溶液分别加入管中，测定管中加入200 μL样本，500 μL试剂一，300 μL试剂二；标准管中加入200 μL 标准品、500 μL 试剂一、300 μL 试剂二；空白管中加入200 μL蒸馏水、500 μL试剂一、300 μL 试剂二。静置后测吸光值，绘图求值。

1.2.1 MTHFR 基因分型检测：使用重庆京因生物科技有限责任公司生产的全自动医用PCR 分析系统，取受试者口腔脱落细胞，取样前确认受试者无口腔牙龈出血，嘱其清水漱口2 次，每次不少于5 s，漱口后吞咽2～3 次，尽量避免口腔内壁残留唾液。取样的拭子90°接近口腔内腮壁，均匀刮5 次，上下为1次。取样后立即将样本放入反应液中，随后上机检测，根据全自动医用PCR 分析系统使用说明书，使用分析软件对采集的数据进行分析，得出MTHFR C677 的基因型检测结果。

1.2.2 收集资料：经过专门训练的采访者编制一份标准化的问卷，对所有参与者进行仔细的遗忘评估和体检。所有患者在发生缺血性脑卒中时进行全面的病史、体格检查和临床生化分析，记录缺血性脑卒中的各种相关危险因素。

1.3 统计学分析 使用统计软件SPSS 20.0进行统计分析。连续数据用均值±标准差（±s）表示，分类数据用百分比（%）表示。连续变量间比较使用t 检验，用卡方检验评估分类变量之间的差异。使用单变量和多变量Logistic回归估计缺血性脑卒中与任何混杂因素之间的比值比（OR）和95%可信区间（CI）。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

缺血性脑卒中患者高血压、糖尿病、血脂异常和高同型半胱氨酸血症的患病率明显更高（P＜0.05）。2 组间吸烟（P=0.21）、饮酒无显著差异（P=0.37），与IS 患者相比，对照组吸烟更多。实验组血浆总同型半胱氨酸水平明显高于对照组（P＜0.001）。TT 和CT基因型组高同型半胱氨酸血症患病率和同型半胱氨酸水平显著高于CC 基因型组（P＜0.001）。见表1。

表1 2组临床资料比较 ［n（%）］Table 1 Comparison of clinical data of two groups ［n（%）］

TT 基因型（6%）在缺血性脑卒中患者中与风险增加相关（P=0.2，OR=2.1），缺血性脑卒中患者MTHFR C677T的CT+TT等位基因频率（49%）明显高于对照组（40%）（P=0.01，OR=2.1）。见表2。

表2 实验组和对照组MTHFR C677T等位基因和基因型频率比较 ［n（%）］Table 2 Comparison of Allele and genotype frequencies of the MTHFR C677T polymorphisms in experimentals and controls ［n（%）］

IS 患者血浆Hcy 平均水平明显升高（OR=109，P＜0.001），超过1/2的缺血性脑卒中患者有高同型半胱氨酸血症（tHcy＞15μmol/L），而只有1%的对照组人员Hcy 水平异常升高，见表3。

表3 实验组和对照组同型半胱氨酸水平比较Table 3 Homocysteine levels in the experimentals and controls

将TT、CT、CC 3 种677T 等位基因的血浆Hcy水平进行对比发现，TT携带者的血浆Hcy平均水平明显高于野生型CC患者。见表4。

表4 MTHFR C677T多态性对血浆同型半胱氨酸浓度的影响Table 4 Influence of MTHFR C677T polymorphisms on plasma homocysteine concentration

3 讨论

缺血性脑卒中的病因机制相当复杂，不是单一因素所决定的，而是多种因素相互作用的结果，目前讨论最多的是环境因素、生活习惯因素和遗传因素等［4，8］。目前认为与缺血性脑卒中相关的遗传异常可能在不同遗传背景的个体中是不相同的，MTHFR C677T 的突变可能参与其中一小部分。虽然全球多个地域已对该基因相关的多种疾病进行了大量研究，但这种突变作为IS 的危险因素的作用还有争议［20-22］。本研究发现，MTHFR C677T 位点变异与缺血性脑卒中相关，且其危害性不论是导致血浆同型半胱氨酸的升高还是导致缺血性脑卒中的易感性均与该位点的T 基因频率有关。此外，其他几个与生活习惯和环境影响相关的危险因素也与缺血的风险相关。

高血浆同型半胱氨酸已被证明是缺血性脑卒中的独立危险因素［5］，目前大量研究表明MTHFR C677T 多态性与之相关，且具有MTHFR TT 基因型的受试者酶活性较低可能是两者因果关系的原因［16-17］。根据这些研究结果提出MTHFR C677T多态性与缺血性脑卒中风险之间存在相关性的可能性。血浆同型半胱氨酸水平升高与MTHFR C677T多态性的存在有关，这可能与新加坡、马来西亚、突尼斯、中国和波兰人群缺血性脑卒中风险的增加有关［23-24］。然而，在土耳其、赞比亚和巴西人群中，MTHFR C677T 多态性与缺血性脑卒中的风险之间未观察到相关性［25-26］。即使是在同一个国家，如印度人对缺血性脑卒中的易感性也有很大的不同，既有降低的风险，也有增加的风险［27-28］。在土耳其人口中，也可以观察到同样的不一致性［29-30］。虽然所有这些研究结果之间的差异尚不清楚，可能是由于样本量的差异，或是MTHFR途径需要的辅助因子，如叶酸或维生素B12的种族差异和营养摄入差异［31-32］。本研究显示，MTHFR C677T 的T 变异携带者与缺血性脑卒中易感性显著相关，与以往大多数研究一致，假设MTHFR C677T 的遗传风险变异可能通过联合调节同型半胱氨酸水平来影响缺血性脑卒中的风险，但需进一步研究揭示MTHFR C677T多态性在缺血性脑卒中中调控的确切机制。

研究认为，生活方式和基因构成均会影响缺血性脑卒中的遗传易感性。许多传统的危险因素，如高血压、糖尿病和高脂血症等与缺血性脑卒中的风险增加有关，这些因素都是可以改变或避免的。本研究通过多因素Logistic回归分析发现，除吸烟与喝酒以外的5个传统危险因素均与卒中风险相关，作为近年来被确定为缺血性脑卒中风险因素的高同型半胱氨酸血症也在本研究中被证实是缺血性脑卒中的危险因素［8，18］。吸烟、喝酒作为已被众多试验证明的缺血性脑卒中危险因素在本研究中结果无意义可能与研究样本量有限相关。本研究表明，MTHFR C677T 多态性以及高同型半胱氨酸血症均与IS 相关，需要进一步的大规模研究调查缺血性脑卒中的其他遗传危险因素以及其可能与Hcy 水平变化的协同作用或影响。如果MTHFR C677T突变与缺血性脑卒中风险确有相关性，对有缺血性脑卒中遗传易感的高危人群的识别将促进缺血性脑卒中防治策略的制定。

本研究不同以往取患者空腹血液进行PCR检测基因的方式，选择提取口腔脱落细胞进行检测，是一种更加简单快速且减少患者痛苦的方式，检测所使用的仪器是由与首都医科大学附属北京天坛医院王拥军教授CHANCE-2 研究合作的京因公司提供的专门用来检测CYP2C19 和MTHFR C677 等基因的PCR 仪器，快速准确。本研究有以下局限性：第一，完成病例数量有限，且不同地区和种族的患者结果可能存在差异，需要扩大研究群体；第二，无法准确了解患者饮食习惯，涉及到叶酸摄入量的影响；第三，选择只研究MTHFR C677T 基因的多态性，但缺血性脑卒中是一种复杂的疾病，在个体中只研究一种基因缺乏说服力，多种基因型的累积效应以及特定基因和环境之间的相互作用可能会导致缺血性脑卒中事件的发生。