视神经脊髓炎谱系疾病缓解期患者外周血补体C5a及相关细胞因子水平与神经损伤的相关性

仝延萍 杨 涛 王静文 赵天佑 康越之 樊永平△

1）首都医科大学附属北京天坛医院，北京 100070 2）北京市密云区中医院，北京 101599

视神经脊髓炎谱系疾病（neuromyelitis optica spectrum disorders，NMOSD）是一种累及中枢神经系统（central nervous system，CNS）的自身免疫性炎性脱髓鞘疾病，临床表现以视神经和脊髓受累为主的各种神经功能缺损症状，70%以上的患者为复发型，症状累加，致残率高，预后差［1-2］。视神经脊髓炎（neuromyelitis optica，NMO）曾被认为是多发性硬化（multiple sclerosis，MS）的一种亚型，随着NMO-IgG［3］及相应靶抗原水通道蛋白4（aquaporin 4，AQP4）［4］的发现，越来越多的证据证实两者在免疫机制、病理特点、临床表现、神经影像学及治疗等方面均有较大不同。2015 年，国际NMO 诊断小组将NMO单独定义取消，将NMO整合进更广义的NMOSD 范畴中，制定了NMOSD 诊断标准［5］。

NMOSD的发病机制尚不完全明确。在人类CNS 的NMO 样病灶中早期可见AQP4 和胶质细胞原纤维酸性蛋白丢失，病灶内B 细胞、少量CD3+T 细胞、巨噬细胞及小胶质细胞浸润，血管周围有大量中性粒细胞、嗜酸性粒细胞与巨噬细胞浸润以及免疫球蛋白和激活的补体复合物沉积［6］。研究发现，NMOSD 患者急性发作期脑脊液中有大量中性粒细胞［6-7］。C5是所有补体激活途径共有的后续活化补体组分，C5a 是补体C5 的裂解产物，是超强炎症介质，NMO 患者脑脊液中C5a 水平显著增高，C5a的受体（C5aR）主要分布在中性粒细胞、星形胶质细胞及小胶质细胞等炎症反应细胞的表面［8］，C5a 与受体结合可促进补体从血管中渗出及炎性细胞的迁移，促进炎性因子的释放，使中性粒细胞活化，促进中性粒细胞脱颗粒、引导中性粒细胞迁移，促进NMO病灶的扩大和炎症过程的延长［6，9-10］。然而，目前NMOSD中性粒细胞功能异常的研究多关注急性发作期［11-12］，关于NMOSD 缓解期C5a 与相关炎性因子变化以及中性粒细胞活化情况研究甚少。因此，本研究纳入NMOSD 缓解期患者及健康对照，分析缓解期NMOSD 患者外周血C5a 与相关炎性因子变化情况及其与患者神经功能损伤水平的相关性。

1 资料与方法

1.1 研究对象 纳入2017-02—2018-04 就诊于首都医科大学附属北京天坛医院的NMOSD患者90例，同时招募45名健康志愿者作健康对照（healthy control，HC）组。所有受试者均签署知情同意书。

纳入标准：（1）NMOSD 患者符合2015 年国际NMO诊断小组制定的诊断标准；（2）病情处于缓解期，且无复发迹象。

排除标准：（1）严重心、肝、肾功能不全及其他影响生命体征平稳的疾病患者；（2）妊娠期或哺乳期患者；（3）研究者认为不适合参加该试验的任何其他情况。

共纳入缓解期NMOSD 患者90 例，女81例，男9 例，女男比例9∶1；年龄（39.6±1.4）岁，发病年龄（36.7±1.4）岁；病程（2.92±0.5）a，复发次数（1.93±0.4）次，ARR（0.82±0.1）次/a，EDSS评分（3.8±0.2）分。HC组45例，女34例，男11例；女男比例3.1∶1，年龄（35±1.26）岁。

1.2 研究方法 （1）临床资料采集：采集患者基本信息、发病年龄、病程、发作次数等资料，计算平均年复发率（annualized relapse，ARR；某阶段复发次数/某阶段时间，单位：次/年），应用扩展残疾量表（expanded disability status scale，EDSS）评分评估患者神经功能损伤情况。（2）标本采集与检测：受试者清晨空腹采血，取静脉血，3 mL 用乙二胺四乙酸抗凝；3.5 mL 不加抗凝剂。2 500 r/min，离心10 min，取上清，分别留取血清、血浆，—80 ℃冰箱冻存备用。 血浆C5、C5a、细胞因子白介素（interleukin，IL）1 β 和肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）α应用多因子检测试剂盒（美国默克密理博公司，货号HCMP1MAG、HCYTOMAG）检测，血清中性粒细胞弹性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）水平应用酶联免疫吸附法试剂盒（英国Abcam 公司，货号ab119553）检测。

1.3 统计学方法 利用SPSS 22.0 对数据进行统计分析。所有的统计检验均采用双侧检验，数据采用均数±标准误（±se）表示，经正态性检验后，正态分布数据两样本均数比较采用t 检验，非正态分布数据2 组数据比较采用Mann-Whitney U 检验；应用多元线性回归分析，分别以NMOSD 缓解期患者的连续性结局指标复发次数、EDSS 评分、ARR 为因变量（Y），以C5a 和NE 表达水平为自变量（X），同时纳入可能影响结局变量的性别、年龄、病程共同分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 外周血C5 与其裂解产物C5a 及相关细胞因子的表达水平 NMOSD 组和HC 组受试者外周血血浆中补体分子C5的表达水平差异无统计学意义（P=0.12），但其裂解产物C5a的表达水平NMOSD组显著高于HC组（P＜0.000 1），缓解期NMOSD 组血浆炎症因子IL-1 β 和TNF-α亦显著高于HC组（P＜0.001，P=0.004），血清NE 表达水平缓解期NMOSD 组较HC 组显著增高（P=0.008）。见表1、图1。

图1 HC组与NMOSD组外周血C5与裂解产物C5a及相关细胞因子表达水平Figure 1 Peripheral blood C5 and lysate C5a and related cytokine expression levels in HC group and NMOSD group

表1 HC组与NMOSD组外周血C5与裂解产物C5a及相关细胞因子表达水平 （±se）Table 1 Peripheral blood C5 and lysate C5a and related cytokine expression levels in HC group and NMOSD group （±se）

表1 HC组与NMOSD组外周血C5与裂解产物C5a及相关细胞因子表达水平 （±se）Table 1 Peripheral blood C5 and lysate C5a and related cytokine expression levels in HC group and NMOSD group （±se）

注：与HC组相比，**P＜0.01

组别HC组NMOSD组血清NE/（pg/mL）1 400±70 1 580±50**n 45 90血浆C5/（ng/mL）22.48±0.47 24.6±0.60血浆C5a/（ng/mL）0.78±0.027 1.09±0.044**血浆IL-1β/（pg/mL）0.77±0.04 1.17±0.06**血浆TNF-α/（pg/mL）14.93±0.68 20.75±1.14**

2.2 缓解期NMOSD 患者外周血C5a 和NE表达水平与不同临床结局的多元回归分析在缓解期NMOSD 患者中，以临床结局复发次数、ARR 和EDSS 评分为因变量，以C5a 和NE表达水平为自变量，控制性别、年龄和病程后进行多元回归分析。结果显示，NE 表达水平与EDSS 评分显著相关（R2=0.29，P=0.00），年龄是影响EDSS评分的独立因素（P=0.03），C5a表达水平与复发次数、ARR和EDSS评分无明显相关性。见表2、图2。

图2 NMOSD患者C5a和NE表达水平与复发次数、ARR和EDSS评分的多元线性回归分析，因变量（Y纵轴变量）与标准化预测值（X轴变量）散点图Figure 2 Multiple linear regression analysis of C5a and NE expression levels and recurrence times，ARR and EDSS scores in NMOSD patients，scatter plot of dependent variable（Y vertical axis variable）and standardized predicted value（X axis variable）

表2 NMOSD患者C5a和NE表达水平与复发次数、ARR和EDSS评分的多元线性回归分析Table 2 Multiple linear regression analysis of C5a and NE expression levels and recurrence times，ARR and EDSS scores in NMOSD patients

3 讨论

NMOSD是中枢神经系统的自身免疫性炎性脱髓鞘疾病，在任何年龄均可发病，中位发病年龄39 岁，青春期前患者无性别差异，青春期后女性患者居多，占患者总数的70%～90%［1-2，13-14］。与AQP4-IgG 相关的NMOSD 相比，MOG-IgG相关的NMOSD在男性和年龄较小个体中更常见［15］。本病一般呈急性或亚急性起病。约50%的患者以孤立性视神经炎起病，出现显著视力下降或视野缺损，其中约20%为双侧。部分患者表现为孤立的脊髓炎，在数小时至数天内出现四肢或躯干的感觉、运动功能障碍，并常出现肠道或膀胱功能障碍。约10%的NMO患者首发症状是视神经炎与脊髓炎并见［16］。NMOSD 70%以上的患者为复发型而非单时相病程，疾病反复发作，发作后残疾叠加，为患者、家庭和社会带来极大负担。

AQP4-IgG 是NMOSD 的特异性抗体。人类NMO 病灶周围常聚集有丰富的中性粒细胞、巨噬细胞和嗜酸性粒细胞，均可通过引起抗体依赖性的细胞介导的细胞毒性作用参加补体依赖的细胞毒性作用［17］。动物实验发现，向小鼠脑内注射从NMO 患者血清中提纯的AQP4-IgG和人补体可形成特征性NMO病灶，而同时注射AQP4-IgG 和鼠补体不能引起特征性NMO样CNS损伤，且向AQP4基因敲除鼠注射NMO-IgG 和人补体亦未产生NMO 样病灶，说明AQP4 及其抗体、人类补体同时存在是NMO 病灶形成的必要条件［9］，补体依赖的星形胶质细胞毒性作用是诱发神经炎症与脱髓鞘过程的主要机制。C5是所有补体激活途径共有的后续活化补体组分，其裂解产物之一C5a是效应最强的补体来源炎症介质，其受体C5aR主要分布于中性粒细胞等炎症反应细胞的表面，C5a 与靶细胞表面C5aR 结合而发挥生物学效应。在CNS 中，C5a 可破坏血-脑脊液屏障（blood brain barrier，BBB），增加BBB通透性，促进补体从血管中渗出及炎性细胞的迁移［18］。人类及动物NMO模型神经病理研究发现，由C5a诱发的炎症反应又可促进C5a的产生，形成正反馈循环，促进NMO病灶的扩大和炎症过程的延长。C5a/C5aR信号通路可增加炎性细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6等的产生，还可抑制中性粒细胞凋亡，延缓炎症的消退［6，9，19-23］。本研究中缓解期NMOSD患者外周血C5a表达水平显著高于健康对照者，且存在炎性细胞因子IL-1β和TNF-α的异常升高，提示缓解期NMOSD 患者体内仍存在C5a/C5aR 通路的异常激活和炎性环境的紊乱。

NE 是一种细胞外基质降解蛋白酶，由中性粒细胞在其活化后释放，NE 异常和过量释放进入组织后可导致各种急慢性炎症性疾病。正常生理情况下中性粒细胞被BBB隔离在CNS实质之外［24］。中性粒细胞向CNS 募集并介导炎症反应、促进髓鞘脱失、调节免疫反应等功能，在NMOSD 的发病机制中发挥重要作用［7，25］。有研究发现，NMO患者在缓解期时其脑脊液中性粒细胞水平仍较正常升高20%［26］，动物实验发现脑内注射NE抑制剂可显著减轻AQP4-IgG 和人补体注射形成的特征性NMO病灶的损伤严重程度［7，26］。团队前期研究显示，NMO 缓解期患者外周血中具有很强粒细胞趋化作用的上皮中性粒细胞激活肽78水平较正常增高［27］，提示缓解期NMOSD 存在中性粒细胞的功能异常。本研究发现，缓解期NMOSD患者血清NE表达水平显著升高，提示存在着中性粒细胞的异常活化。

本研究以临床结局复发次数、ARR 和EDSS评分为因变量，以C5a和NE表达水平为自变量，控制性别、年龄和病程后，进行多元回归分析，结果显示，NE 表达水平与患者EDSS评分显著正相关，年龄是影响EDSS 评分的独立因素，未发现C5a 表达水平与复发次数、ARR 和EDSS 评分相关性。这提示虽然缓解期NMOSD 患者病情较为稳定，无明显急性CNS炎症表现，但患者体内仍存在着中性粒细胞的异常活化与炎性环境的紊乱，中性粒细胞的异常活化对患者神经功能损伤具有不良影响。

本研究证实了缓解期NMOSD患者仍存在着C5a 异常升高所导致的中性粒细胞异常活化和炎性因子的异常升高，血清NE 表达水平可能是反映NMOSD临床预后的核心指标之一。