微小RNA-33a 对平滑肌细胞表型转化的调控机制研究

常峥峥，林飞，赵晖，李扬，刘懿，李东旭，赵国安

动脉粥样硬化（AS）是冠心病等疾病的病理基础，而冠心病等心脑血管疾病严重危及生命健康，每年导致大量患者死亡[1]。平滑肌细胞（SMC）表型转化是AS 发生、发展的重要环节。正常情况下，SMC 位于血管中膜，起着收缩血管和保持血管弹性的功能，此时的SMC 为收缩表型，细胞高度分化，特点是低增殖率、低迁移率和分泌少量细胞外基质，标志物有平滑肌肌动蛋白α（ACTA2）、平滑肌22α（TAGLN）、肌球蛋白重链11（MYH11）、钙调蛋白1（CNN1）等。而血小板衍生生长因子-BB（PDGF-BB）可诱导SMC 去分化，从收缩表型向合成表型转化，SMC 增殖能力、迁移能力及合成细胞外基质能力升高，具有部分“干细胞”潜质，其标志物骨桥蛋白（OPN）表达升高，从而促进AS 的进展[2]。因此，探究SMC 表型转化相关调节机制可以为AS的诊疗提供新的观点。

微小RNA（miRNA）是一类保守的、小的（22～24个核苷酸）非编码RNA，位于基因组内或基因序列中。miRNA 是转录后基因调控的关键调控因子，通过与靶基因信使RNA（mRNA）结合，以降解并抑制翻译来发挥作用，单个miRNA 可能同时影响数百甚至数千个基因[3]，或数个miRNA 同时调节一个基因。而miRNA 在SMC 表型转化中是否发挥重要调控作用，目前尚不明确。因此，寻找未在SMC 表型转化中研究或研究较少的miRNA 具有重要意义。

miR-33a 在AS 中的作用主要是通过介导三磷酸腺苷（ATP）结合盒转运蛋白A1（ABCA1）的表达来影响巨噬细胞胆固醇代谢[4]，在肿瘤方面还可通过周期蛋白依赖性激酶-6（CDK-6）来影响细胞增殖[5]。而miR-33a 是否对SMC 具有调控作用，能否参与其表型转化，文献报道较少。磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路作为经典通路具有多种功能：是细胞内重要的信号传导通路，影响缺氧诱导因子1的表达[6]，影响细胞的增殖、凋亡、自噬等过程[7]。本研究旨在探究miR-33a 是否通过PI3K/Akt/mTOR通路调控SMC 表型转化，为AS 的机制研究提供可参数据。

1 材料与方法

主要材料：原代人主动脉SMC（HASMC）及SMC 培养基（SMCM）购于美国Sciencell 公司，PDGF-BB 购于美国R&D 公司，噻唑蓝（MTT）、二奎啉甲酸（BCA）试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司，多聚赖氨酸（PLL）购于北京索莱宝科技有 限 公 司，miR-33a、ACTA2、TAGLN、OPN 及甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）引物合成于苏州金唯智生物科技有限公司，miRNA 及mRNA 反转录及实时荧光定量PCR（RT-qPCR）试剂盒购于TaKaRa 公司，miRNA 沉默（inhibitor）、过表达（mimics）、无义序列（NC）、沉默NC（inhibitor NC）由上海吉玛基因生物有限公司合成，脂质体Lipofectamine RNAiMAX Reagent 购买于美国赛默飞世尔科技公司，放射免疫沉淀测定（RIPA）蛋白裂解液购于上海雅酶生物科技有限公司，磷酸化兔抗p-PI3K、p-Akt、p-mTOR 购 于 美 国Cell Signaling Technology 公司，鼠抗β 肌动蛋白（β-actin）购于美国Proteintech 生物公司。

细胞培养：首先PLL 包被培养瓶（皿），用含5%胎牛血清及含有SMC 生长因子的SMCM 于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中常规培育、传代，第3～7 代用于实验。

细胞处理：HASMC 接种于96 孔板，分别给予不同浓度（10、20、50、80、100 ng/ml）PDGF-BB处理24 h、48 h。HASMC 接种于60 mm 培养皿，加入20 ng/ml PDGF-BB 处理48 h。

实验分组：确定用药浓度后分为对照组、PDGF-BB 组（20 ng/ml PDGF-BB 诱 导HASMC）；转染细胞48 h 后分为NC 对照组、miRNA 过表达组（miR-33a mimics）、沉默NC+诱导组（inhibitor NC+PDGF-BB 诱导HASMC）、miRNA 沉默+诱导组（miR-33a 敲减inhibitor+PDGF-BB 诱导HASMC）。

细胞增殖检测：PDGF-BB 分别处理细胞24 h 及48 h 加入MTT（20 μl/孔），37℃培养箱中孵育4 h，加二甲基亚砜150 μl 溶解蓝紫色结晶甲臜，酶联免疫检测仪测A490 nm 波长吸收值。计算细胞活力公式为：细胞活力=（处理组A 值-空白组A 值）/（对照组A 值-空白组A 值）×100%。

细胞迁移能力检测（细胞划痕实验）：细胞接种于背后划线的6 孔板，待第二天贴壁后用枪头划线，磷酸缓冲盐溶液（PBS）清洗3 次，分别加入不同 浓 度（10、20、50、80、100 ng/ml）PDGF-BB，放入37℃、5% CO2培养箱培养，在0、24、48 h 取样拍照。

miRNA 筛选：为寻找可能在SMC 表型转化中具有调控作用的miRNA，将建立好的模型细胞送做RNA 测序，根据测序结果挑选在模型中表达存在差异的miRNA，并进行验证。

验证miR-33a 功能：细胞传代至6 孔板（2×105个/孔），生长至70%～80%融合时进行转染。按照Lipofectamine®RNAiMAXReagent 转染试剂说明书操作，应用无血清的SMCM 分别稀释miR-33a inhibitor、inhibitor NC、miR-33a mimics、NC（转染混合液A）及 转 染 试 剂Lipofectamine®RNAiMAX Reagent（转 染混合液B），转染混合液A 及转染混合液B 按1：1 体积充分混匀，室温孵育5 min 后滴入6 孔板，轻摇均匀，放入细胞培养箱。NC 对照组、miRNA 过表达组给予更换新鲜培养基继续培养48 h；沉默NC+诱导组、miRNA 沉默+诱导组更换含PDGF-BB 终浓度为20 ng/ml 的新鲜培养基温箱孵育48 h。

RT-qPCR 检 测：PBS 清 洗 细 胞2 遍， 加 入RNAisoplus 试剂裂解细胞，混匀震荡后冰上裂解10 min；加入三氯甲烷200 μl，冰上静置15 min 后，4℃离心机12 000 转/min，离心15 min；加入异丙醇500 μl，冰 上 静 置10 min，4 ℃离 心 机，12 000 转/min，离心10 min，弃上清保留沉淀，75%乙醇清洗沉淀后应用焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶解。超微量分光光度仪检测RNA 浓度及纯度（A260/A280 比值在1.8～2.0）。TaKaRa 反转录试剂盒进行miRNA 及mRNA 反转录，扩增试剂盒进行RT-qPCR，检测miRNA、mRNA 表达情况，采用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。

蛋白免疫印迹（Western blot）分析：RIPA 法提取总蛋白，BCA 试剂盒检测蛋白浓度。等量上样，用10%和12% SDSPAGE 聚丙烯酰胺凝胶，电泳上层胶60 V 40 min，下层胶100 V 90 min，转膜[聚偏二氟乙烯（PVDF）膜]300 mA 90 min，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，一抗4℃孵育过夜，次日TBST 缓冲液洗膜后，二抗室温孵育1 h，化学发光凝胶成像分析系统成像显影，ImageJ 软件进行灰度值分析。

统计学方法：采用SPSS 25.0 软件进行统计分析、GraphPad Prism 8 绘图。计量资料采取均数±标准差（±s）表示，多组分析采用单因素方差分析，组间比较采取LSD 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 平滑肌细胞表型转化模型建立

细胞增殖率检测：MTT 检测结果显示，与不处理相比，使用不同浓度（10、20、50、80、100 ng/ml）PDGF-BB 分别诱导24 h、48 h 后，HASMC 的增殖率均明显升高（P均＜0.01），其中以20 ng/ml 浓度处理48 h 后增值率[（183.607±6.188）%]升高最为明显[不处理时为（100.000±3.756）%，P＜0.0001]。

细胞迁移能力检测：细胞划痕实验显示，与不处理相比，使用不同浓度（10、20、50、80、100 ng/ml）PDGF-BB 分别诱导24 h、48 h 后，HASMC的迁移率均明显升高，其中以20 ng/ml 处理48 h时迁移率升高最明显。因此，结合MTT 检测与细胞划痕实验结果后，最终选择PDGF-BB 浓度为20 ng/ml处理48 h作为SMC表型转化模型建立的浓度。

SMC 标志物表达量检测：RT-qPCR 检测结果显 示，PDGF-BB 组HASMC 经 诱 导 后，ACTA2、TAGLN mRNA 表 达 水 平（ 分 别 为0.081±0.004、0.235±0.010）较对照组（1.003±0.095、1.001±0.054）均明显下降（P均＜0.0001），OPN mRNA 表达水平（3.472±0.227）较对照组（1.017±0.235）则明显升高（P＜0.001）。Western blot 结果也显示，与对照组相比，PDGF-BB 组HASMC 经 诱 导 后，ACTA2、MYH11、CNN1 蛋白表达量均下降，OPN 蛋白表达量则升高（P均＜0.05），见图1。

图1 Western blot 检测PDGF-BB 诱导对HASMC 表型转化相关标志物蛋白表达量的影响(n=3)

PI3K/Akt/mTOR 通路检测（图2）：Western blot 结果显示，与对照组比较，PDGF-BB组HASMC经诱导后，p-PI3K（1.00±0.02 vs. 1.11±0.01）、p-Akt（1.00±0.04 vs. 1.90±0.01）、p-mTOR（1.00±0.03 vs. 1.12±0.01）蛋白表达量均升高（P均＜0.05），说明PDGF-BB 诱导可激活PI3K/Akt/mTOR 通路，影响SMC 表型转化。

图2 Western blot 检测PDGF-BB 诱导对HASMC 中PI3K/Akt/mTOR 蛋白表达量的影响(n=3)

2.2 miRNA 筛选及验证

从测序结果中挑选表达量具有差异的miRNA进行验证，结果发现，miR-33a 差异最明显。

2.3 验证miR-33a 在平滑肌细胞表型转化中的功能

与NC 对照组相比，miRNA 过表达组细胞中miR-33a 表达量显著升高（P＜0.001），ABCA1、ACTA2、TAGLN mRNA 表达水平显著降低（P分别＜0.001、＜0.01、＜0.05），见图3。

图3 RT-qPCR 检测过表达miR-33a 对HASMC 中miR-33a（3A）及各标志物mRNA（3B）表达量的影响(n=3)

与 沉 默NC+ 诱 导 组 相 比，miRNA 沉 默+ 诱导组细胞中miR-33a 表达量显著降低，ABCA1、ACTA2 mRNA 表达水平均显著升高，OPN mRNA 表达水平显著降低（P均＜0.01），见图4。

图4 RT-qPCR检测沉默miR-33a+PDGF-BB诱导对HASMC中miR-33a（4A）及各标志物mRNA（4B）表达量的影响(n=3)

Western blot 结果显示，与NC 对照组相比，PDGF-BB 组HASMC 经 诱 导 后，ACTA2、CNN1 蛋白表达量均下降（P均＜0.001），OPN 蛋白表达量升高（P＜0.01）；miRNA 过表达组ACTA2、CNN1 蛋白表达量下降（P分别＜0.01 和＜0.05），OPN 蛋白表达量升高（P＜0.001）；与miRNA 过表达组相比，miRNA 沉默+诱导组ACTA2、CNN1 蛋白表达量均升高（P＜0.05 和＜0.01），OPN 蛋白表达量下降（P＜0.01），见图5。

图5 Western blot 检测转染miR-33a 对HASMC 各标志物蛋白表达量的影响(n=3)

划痕实验结果显示，与NC 对照组相比，miRNA 过表达组细胞迁移能力升高，而miRNA 沉默+诱导组细胞迁移能力降低，见图6。

图6 细胞划痕实验检测转染miR-33a±PDGF-BB 处理后对HASMC 细胞迁移能力的影响(×4)

2.4 验证miR-33a 对PI3K/Akt/mTOR 通路的影响（图7）

图7 Western blot 检测转染miR-33a 对HASMC 中PI3K/Akt/mTOR 通路蛋白表达量的影响(n=3)

Western blot 结果显示，与NC 对照组相比，PDGF-BB 组HASMC 的PI3K/Akt/mTOR 通路被激活；miRNA 沉默+诱导组p-PI3K、p-Akt、p-mTOR 蛋白表达量下降（P均＜0.05）；miRNA 过表达组p-PI3K、p-Akt、p-mTOR 蛋白表达量明显高于miRNA 沉默+诱导组（P均＜0.01）。

3 讨论

SMC 是血管的重要组成部分，正常情况下位于血管中膜，起到维持血管张力和收缩血管的功能。当内皮损伤、存在血脂异常或慢性炎症时，SMC 会被诱导去分化，从“收缩表型”转化为“合成表型”，表现为收缩标志蛋白表达下降、细胞增殖和迁移能力升高[8]。本研究使用PDGF-BB 诱导HASMC 构建表型转化细胞模型，使SMC 从收缩表型向合成表型转化，其增殖、迁移能力升高，收缩表型标志物ACTA2、TAGLN、CNN1 及MYH11 等表达降低，合成表型标志物OPN 表达升高，该过程参与AS 斑块的发生和发展[9]，因此，探究SMC 表型转化可以为AS 机制研究和治疗靶点提供可参数据。

近年来的研究表明，很多miRNA 参与AS 的发生、发展。miR-22-3p[10]、miR-214-3p[11]调控SMC分 化；miR-302a 促 进SMC 的 增 殖 和 迁 移[12]；miR-34a 促进SMC 钙化[13]；let-7 miRNA 家族可抑制SMC的炎症反应[14]，miR-155 影响SMC 的表型转化[15]，27nt-miRNA 可抑制SMC 凋亡[16]，均调控SMC 的功能，影响AS 的发生和发展。本研究旨在寻找在SMC 表型转化中具有调控作用的miRNA，因此通过对正常SMC 和加PDGF-BB 诱导的SMC 进行测序分析，筛选表达有差异的miRNA 进行验证，发现miR-33a 异常增高。miR-33a 是miR-33 家族（包括miR-33a 和miR-33b）一员，miR-33a 位于22 号染色体上SREBP-2 基因的第15 内含子中，miR-33b 存在于17 号染色体上SREBP-1 基因的第17 内含子中[17]。miR-33a 最重要的靶蛋白是ABCA1，而ABCA1 是细胞内胆固醇从肝脏流出到载脂蛋白A1以产生高密度脂蛋白的关键介质，因此miR-33a 主要与胆固醇代谢相关[18]。本研究通过沉默或过表达miR-33a 后检测SMC 表型转化相关指标，发现单纯过表达miR-33a 后收缩表型标志物表达降低、合成表型标志物表达升高、SMC 的迁移能力得到提升，这提示miR-33a 有可能参与SMC 表型转化；而PDGF-BB 诱导的同时沉默miR-33a 可逆转PDGFBB 引起的表型转化。由此，我们确定miR-33a 对SMC 表型转化具有显著的调控作用。

同时，使用PDGF-BB 诱导后SMC 发生表型转化时，PI3K/Akt/mTOR 信号通路被激活。在AS 中，氧化型低密度脂蛋白诱导的巨噬细胞源性泡沫细胞即是通过PI3K/Akt/mTOR 信号传导实现的[19]，当PI3K/Akt/mTOR 信号通路中的p-Akt 和p-mTOR 表达降低时，还可促进巨噬细胞自噬[20]。而且，PI3K/Akt/mTOR 信号通路的激活不仅可刺激内皮细胞损伤[21]，还影响SMC 的增殖[22]和凋亡[23]。本研究在验证miR-33a 对SMC 表型转化的调控作用的同时，还发现沉默或过表达miR-33a 可影响PI3K/Akt/mTOR 信号通路的激活状态，说明miR-33a 可能通过PI3K/Akt/mTOR 信号通路来发挥其对SMC 表型转化的调控作用。

综上所述，本研究显示，miR-33a 可激活PI3K/Akt/mTOR 信号通路，促进SMC 表型转化，加快AS 的发生和发展，提示miR-33a 有成为AS 新治疗靶点的可能，但其发挥作用的具体靶向与机制尚需进一步研究。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突