NMR技术应用于手性识别实验教学的设计

田小艳， 罗 琳， 蒋京辰， 李梅珊

（1.广西师范大学化学与药学学院，省部共建药用资源化学与药物分子工程国家重点实验室/广西民族药省部共建协同创新中心，广西桂林541004；2.钦州市生态环境局钦州市固体废物管理中心，广西钦州535000）

0 引 言

在化学相关专业中最为重要的一个教学部分就是实验教学，但是目前的化学实验教学方式已经不能满足当代社会对创新型人才的需求。因此，需要强化创新型教学实验设计的力度，培养学生独立设计并完成创造性实验，提高学生自主创新能力，为将来的科研和生产实践奠定基础［1-3］。基于提升学生创新实践能力这一培养目标，充分利用本校现有教学仪器资源，将羧酸类手性溶剂化试剂（Chiral Solvating Agents，CSAs）的制备及其通过核磁共振（NMR）法对R/S-萘乙胺进行手性识别等研究内容设计成创新性综合实验，教授学生相关理论知识、实验技巧及如何运用理论知识解决实际问题，培养学生实验设计和创新思维能力，也使学生充分了解本学科当前研究现状和从事化学行业所需具备的专业技能，能够调动他们对本专业知识学习的兴趣。

目前，临床上使用的药物约有1/3是手性药物。但是，由于手性化合物的绝对立体结构在决定它们的特殊重要化学、物理、生物、药学的性质上起了最关键作用，所以这些化合物中往往只有其中一种构型的光学异构体具有药理活性，而另一种光学异构体则可能不具有任何药理活性甚至会对人体有毒副作用。因此手性化合物的识别在新药研发和活性药物筛选中至关重要。近年来，手性化合物的分析方法常用的有高效液相色谱法和NMR法等，其中NMR法具有快速、方便、样品用量少且可回收等优点而备受关注［4-5］。而手性溶剂化试剂分析法是NMR技术研究手性化合物的主要方法之一。手性溶剂化试剂主要是能与两个对映异构体通过非共价键、范德华力和氢键等形成非对映络合物，从而使对映体的NMR信号的化学位移有所偏差以达到手性识别的目的［6-8］。目前已有许多优秀的手性识别试剂被发现或合成，但是目前商品化的手性溶剂化试剂的价格都非常昂贵，如常用的（S）-MPA和18-C-6-TCA25试剂仅25 mg就需要上百美元。因此，这些价格昂贵的识别试剂显然不适合用于常规本科实验教学。经了解发现松香［9］是一种重要的且廉价易得的可再生资源，而酒石酸［10］是一种常见于酒类和其他葡萄类产物中的物质，都极易大量获取且价格便宜，较适合用于大规模的本科实验教学。

1 实验设计思路

酒石酸和从松香中提取得到含有3个手性碳原子的脱氢松香酸由于结构中都含有可以与胺类发生良好反应的羧基基团，可作为识别胺类的手性溶剂化试剂。但是酒石酸的识别效果并不明显，因此需要在酒石酸结构上增加苯环结构以增大手性识别试剂的磁各向异

性，使手性化合物的NMR信号裂分效果更加明显。基于以上考虑，本实验首先从松香中提取纯净的脱氢松香酸、通过有机合成方法对酒石酸进行结构改造制备L-二苯甲酰酒石酸，然后以这两种羧酸作为手性溶剂化试剂，对R/S-萘乙胺通过1H NMR谱图进行手性识别研究。理论上，该主体与客体有两种结合方式：一种是主体的羧基通过氢键与客体的氨基结合；另一种是由于主体和客体都有苯环存在，因此可以通过π-π堆积和磁各向异性作用形成稳定的络合物结构。当主客体体系中主体与客体形成稳定的络合物后，此时R/S-萘乙胺被施加一个不对称的环境，使其处于非对映异构关系下产生化学位移不等价，进而使得R/S-萘乙胺1H NMR谱图上的次甲基和甲基基团的氢信号出现裂分，通过分析这些信号的变化情况及R-萘乙胺手性质子的化学位移δR和S-萘乙胺手性质子的化学位移δS之间的差异，计算化学位移差值ΔΔδ（ΔΔδ=

2 实验材料和仪器

2.1 仪器

BRUKER AVANCE 500 MH超导核磁共振仪（瑞士，布鲁克公司）；WRSI-1A数字熔点仪（上海精密科学仪器公司）；DLSB-5/20型低温冷却液循环泵（郑州长城科工贸有限公司）；SHB-Ⅲ循环多用真空泵；ID-300.ID-300.3多功能电子天平；RE-5.2AA旋转蒸发器；D-8401型多功能搅拌器。

2.2 试剂

歧化松香、95%乙醇、乙醇胺、石油醚、稀盐酸、酒石酸、苯甲酰氯、苯，上述药品除歧化松香、95%乙醇为工业等级以外，其余全为分析纯。

2.3 实验对象

以脱氢松香酸和L-二苯甲酰酒石酸两种手性羧酸作为主体，即为NMR手性溶剂化试剂，分别对客体R/S-仲丁胺萘乙胺进行手性识别，其化学结构式分别为：

3 实验内容

3.1 主体化合物的制备

（1）脱氢松香酸的纯化［11］。将200 g工业歧化松香加入2 000 mL烧瓶中，加入500 mL 95%乙醇并加热溶解工业歧化松香后趁热抽滤。滤液趁热加入40 g乙醇胺和500 mL热水，用100 mL石油醚萃取5次，胺层冷却后结晶，过滤，沉淀用50%乙醇重结晶得纯净脱氢松香酸盐，将脱氢松香酸盐溶解于700 mL 50%热乙醇中，用稀盐酸调节pH=4，冷却，过滤，并用水洗涤沉淀，真空干燥，得白色晶体即为脱氢松香酸45 g，使用WRSI-1A数字熔点仪测其熔点为170.1～171.5℃，其反应式为：

（2）L-二苯甲酰酒石酸的合成［12］。向100 mL烧瓶中加入1 g酒石酸和3 g（4 mL）的苯甲酰氯，并置于油浴锅中，调节油浴使温度升至140～150℃，回流并搅拌3 h后，停止加热，加入3 mL苯于烧瓶中，继续回流反应5 min，待反应体系冷却到室温后进行减压抽滤，用苯洗涤滤饼两次，抽滤并干燥，得白色针状固体即为L-二苯甲酰酒石酸2.1 g，使用WRSI-1A数字熔点仪测其熔点为194.7～196.0℃，其反应式为：

3.2 手性识别作用的1H NMR测定

以主体脱氢松香酸和L-二苯甲酰酒石酸为NMR手性溶剂化试剂，采用1H NMR测定法对客体R/S-萘乙胺分别进行手性识别研究。测定方法是固定客体浓度不变，依次加入主体的量进行测定（采取连续加样连续测量的方式）。实验具体步骤如下：

（1）20℃下，在核磁管中加入R/S-萘乙胺（0.05 mol），加入0.5 mL CDCl3作为溶剂，逐渐加入一定量的脱氢松香酸，每加入一次便进行1H NMR测定，得到一系列脱氢松香酸-R/S-主客体体系的1H NMR谱图。

（2）20℃下，在核磁管中加入R/S-萘乙胺（0.05 mol），加入0.5 mL CDCl3作为溶剂，逐渐加入一定量的L-二苯甲酰酒石酸，每加入一次便进行1H NMR测定，得到一系列L-二苯甲酰酒石酸-R/S-萘乙胺主客体体系的1H NMR谱图。

4 结果与分析

4.1 谱图分析

从图1所示可见，在脱氢松香酸对R/S-萘乙胺手性识别实验中，客体R/S-萘乙胺分子中手性质子（CH）的信号随着主体脱氢松香酸的增加逐渐向低场方向位移，并由原来的四重峰逐渐裂分成六重峰。在主体浓度∶客体浓度=0.7∶1时手性质子就已经开始裂分，但是随后由于受到水峰的干扰导致裂分效果不明显；当主体浓度∶客体浓度达到1∶1之后，就趋于稳定，且主体浓度∶客体浓度=1∶1时，脱氢松香酸对手性质子的识别效果最好，ΔΔδ达到最大值，为3.35 Hz。R/S-萘乙胺分子中CH3的信号随着主体脱氢松香酸的增加也逐渐向低场方向移动（见图2），但主体对其识别效果并不明显；当主体浓度∶客体浓度=0.7∶1时，CH3的二重峰开始有细小裂分为四重峰现象，此时ΔΔδ为1.2 Hz，但是随后四重峰就开始回缩。可见，脱氢松香酸对R/S-萘乙胺有一定的识别效果，对手性质子（CH）识别效果优于CH3的识别效果。

图1 不同浓度脱氢松香酸对R/S-萘乙胺的1H-NMR识别局部（CH）放大图谱

图2 不同浓度脱氢松香酸对R/S-萘乙胺的1H-NMR识别局部（CH3）放大图谱

在L-二苯甲酰酒石酸对R/S-萘乙胺手性识别实验中，在主体L-二苯甲酰酒石酸加入后客体R/S-萘乙胺手性质子（CH）信号向高场方向位移，但随着主体含量的增加信号开始逐渐向低场方向位移（见图3）。当主体浓度∶客体浓度=0.4∶1时，主体对客体才具有明显识别效果，客体的手性质子信号由原来的四重峰开始裂分为五重峰；当主体浓度∶客体浓度=0.6∶1时，主体对手性质子识别效果最强，ΔΔδ达到最大值，为7.25 Hz；当主体浓度继续增加，手性质子的五重峰就开始回缩。此外，主体浓度∶客体浓度从0.4∶1向1.2∶1变化时，CH裂分峰向低场移动不是很明显。在R/S-萘乙胺的CH3位置，L-二苯甲酰酒石酸也具有明显的识别效果（见图4），主体加入后，客体的CH3信号向高场方向位移。在主体浓度∶客体浓度=0.4∶1时，CH3的质子信号由双重峰已明显裂分为四重峰；当主体浓度∶客体浓度=0.8∶1时，ΔΔδ达到最大值，为7.6 Hz，此时CH3的质子信号为三重峰。

图3 不同浓度L-二苯甲酰酒石酸对R/S-萘乙胺的1H-NMR识别局部（CH）放大图谱

图4 不同浓度L-二苯甲酰酒石酸对R/S-萘乙胺的1H-NMR识别局部（CH3）放大图谱

4.2 曲线分析

将一系列主客体体系的主体摩尔分数与客体化学位移差值ΔΔδ绘制成曲线。由图5可见，随着脱氢松香酸摩尔分数的增加，R/S-萘乙胺的次甲基质子的ΔΔδ逐渐增加；当脱氢松香酸的摩尔分数为0.50时，ΔΔδ出现峰值，说明此时脱氢松香酸与R/S-萘乙胺形成的络合物最稳定，主体对客体的识别效果最显著。同样地，在L-二苯甲酰酒石酸对R/S-萘乙胺手性识别实验中，R/S-萘乙胺的甲基质子信号的ΔΔδ值随着L-二苯甲酰酒石酸摩尔分数的增加而逐渐增加（见图6），当L-二苯甲酰酒石酸摩尔分数为0.44时，ΔΔδ出现峰值。

图5 R/S-萘乙胺次甲基质子化学位移差值ΔΔδ与脱氢松香酸浓度的变化曲线

图6 R/S-萘乙胺次甲基质子化学位移差值ΔΔδ与L-二苯甲酰酒石酸浓度的变化曲线

5 结 语

本实验设计从价格便宜且易得的松香和酒石酸原料中通过一些简单的有机方法制备NMR手性溶剂化试剂脱氢松香酸和L-二苯甲酰酒石酸，并采用NMR技术研究不同浓度下两种手性溶剂化试剂对R/S-萘乙胺进行手性识别效果，分析讨论两种羧酸的最优识别效果最佳浓度比值。实验过程中涉及到化合物提纯、有机合成和结构表征仪器核磁共振仪的使用等，涵盖多方面的专业理论知识和实验操作方法实验，具有简易性、综合性和创新性的特点，可以培养学生的综合实践技能和理论知识运用分析能力。此外，还可以加强大型精密测试仪器的开放和提高大型仪器在本科实验教学中的使用效益［13-15］。