百里香酚和肉桂醛联用对沙门氏菌的协同抑菌效应及其应用

胡心怡，胡郁汉，潘振辉，李志成，肖性龙，余以刚*

（1.华南理工大学食品科学与工程学院，广东广州 510640）（2.广州酒家集团利口福食品有限公司，广东广州 510641）

近年来，食源性细菌感染是威胁公共卫生安全中的严重问题。沙门氏菌是革兰氏阴性菌，适宜在10～42 ℃的环境下生存，100 ℃下持续20～30 min 才可被杀死，是鸡肉中常见致病菌之一。沙门氏菌感染能够引发败血症、肠胃炎等疾病，严重时甚至导致患者死亡[1]。2019 年美国报告了与受污染家禽相关的沙门氏菌病1134 例[2]。关于致病菌的减控近年来取得了较大发展，研究表明，植物精油可以有效抑制致病菌的生长，减少微生物对脂肪和蛋白质的氧化，可用于延长肉类制品的保质期[3-5]。此外，随着消费者对食品质量要求提高，绿色、无危害的植物源天然抑菌剂也已成为了研究的焦点。

百里香酚（2-异丙基-5-甲基苯酚）是一种天然的单萜酚，具有抗氧化、抗菌活性，是牛至精油、百里香精油、冬香薄荷精油中的主要活性成分之一[6-8]。肉桂醛是一种黄色粘稠状的醛类有机化合物，是肉桂精油、风信子油等中的主要活性成分之一，具有较强的抗氧化、抗菌活性[9-10]。百里香酚和肉桂醛对人体无毒无害，已被美国联邦药品管理局（FDA）批准用于食品以及食品添加剂[11]，我国《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》中也将百里香酚和肉桂醛批准为可在食品中使用的天然防腐剂[12]。目前关于肉桂醛和百里香酚的理化性质，抑菌机理，生物活性，化学合成，包埋和传递等方面都取得了较大的进展，单一使用肉桂醛和百里香酚均可取得较好的抑菌效果，而针对低剂量百里香酚和肉桂醛的复配及其抑菌效果仍然较少。因此，本研究考察了百里香酚与肉桂醛联合处理沙门氏菌的抑菌效应，并将其应用于盐焗鸡保鲜中以探究相应的保鲜效果，以期为百里香酚和肉桂醛更好地应用于食品产业保鲜提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料与试剂

冻鲜鸡：广州酒家利口福食品有限公司提供；无水乙醇（分析纯）、百里香酚（分析纯）、肉桂醛（分析纯）：购于阿拉丁（上海）有限公司。

1.1.2 培养基及菌种

胰酪大豆胨液体培养基（TSB）、胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA），购于广东环凯微生物科技有限公司；肠炎沙门氏菌 CCTCC AB 94018（Salmonella enteritidis）和鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028（Salmonella typhimurium），华南理工大学食品安全与控制实验室提供。

菌种均在TSB 中活化，37 ℃，180 r/min 摇床培养24 h，调整菌悬液浓度为6 lg(CFU/mL)后备用。

1.1.3 主要仪器设备

DM IRB 型荧光倒置显微镜，德国Leica 仪器有限公司；En Spire 酶标仪，美国Perkinelmer 公司；S-3700N 扫描式电子显微镜，德国蔡司公司；KDC-40恒温培养箱，科大创新股份有限公司中佳分公司；SHZ-88A 立式高压灭菌锅，江苏太仓市实验设备厂。

1.2 实验方法

1.2.1 百里香酚和肉桂醛最小抑菌浓度、最小杀菌浓度及联合抑菌指数的测定

采用微量梯度稀释法对百里香酚和肉桂醛对沙门氏菌的最小抑菌浓度（minimuminhibitory concentration，MIC）进行测定。用50%乙醇将百里香酚和肉桂醛配制为128 mg/mL 的储备液，然后用无菌水稀释成一系列双倍浓度梯度，加入100 μL 备用菌液，充分混匀，使其最终浓度为32 mg/mL、16 mg/mL、8 mg/mL、4 mg/mL、2 mg/mL、1 mg/mL、0.5 mg/mL、0.25 mg/mL、0.125 mg/mL、0.0625 mg/mL，加入等倍体积TSB 的孔为阴性对照，以不加菌悬液的孔为阳性对照。将96 孔板置于37 ℃培养箱中培养24 h。以96孔板中肉眼不可见浑浊的最低浓度即为MIC。

取100 μL 混合菌液于20 mL TSB 培养基中，置于37 ℃，180 r/min 摇床培养24 h 后，取100 μL 混合菌液于TSA 培养皿中，均匀涂布，置于37 ℃培养24 h，无菌体生长的最低浓度即为最小杀菌浓度（minimal bactericidal concentration，MBC）。

根据Fratini等[13]的方法测定百里香酚和肉桂醛的分级抑菌浓度指数（fractional inhibitory concentration index，FICI）。按下式计算FICI 值。

式中：

单独MICA——单一组分A 的MIC；

单独MICB——单一组分B 的MIC；

复配MICA——A 在组合中的有效浓度；

复配MICB——B 在组合中的有效浓度。

结果判定标准：当0.5＜FICI≤0.75 时，表示A与B 之间在抑菌作用中为协同作用；当0.75＜FICI≤1.0，表示A与B 之间存在相加作用；当1＜FICI≤2 时，表示A与B 之间在抑菌作用中不相关；当FICI≥2 时，表示A与B 之间在抑菌作用中为拮抗关系。

1.2.2 百里香酚和肉桂醛联合处理沙门氏菌时时间-杀菌曲线的测定

将百里香酚和肉桂醛加入备用菌液中，使其终浓度为1/4 MIC 百里香酚+1/4 MIC 肉桂醛，1/2 MIC 百里香酚+1/2 MIC 肉桂醛，空白组加入等体积0.85%生理盐水，然后置于37 ℃、180 r/min 摇床培养。在0、0.5、1、2、4、6、8、12、24 h 取样并采用平板计数法测定培养活菌数。以时间为横坐标，活菌数的对数值为纵坐标绘制时间-杀菌曲线。

1.2.3 百里香酚和肉桂醛联合处理对沙门氏菌细胞膜完整性的测定

1.2.3.1 沙门氏菌细胞膜完整性观察

根据李建菲[14]的方法适当的修改，将沙门氏菌过夜培养至对数期备用。实验组为1/4 MIC百里香酚+1/4 MIC 肉桂醛、1/2 MIC 百里香酚+1/2 MIC 肉桂醛，空白对照组为等体积生理盐水，在恒温培养箱中进行孵育（37 ℃，4 h）后离心（8000 r/min，25 ℃，3 min）。收集菌体之后加入100 μL PI 染液涡旋混匀30 s。在室温避光染色15 min 后离心（8000 r/min，25 ℃，3 min）。将染液吸收，加入等体积PBS涡旋混匀30 s。吸取5 μL菌液到载玻片上进行观察拍照。

1.2.3.2 沙门氏菌细胞膜完整性分析

将沙门氏菌过夜培养至对数期备用。取1 mL 备用菌液离心（8000 r/min，25 ℃，3 min），收集菌体，并用PBS缓冲液洗涤3次后并重悬于1 mL含1/4 MIC百里香酚+1/4 MIC 肉桂醛，1/2 MIC 百里香酚+1/2 MIC 肉桂醛的PBS 缓冲液中，空白组为等体积PBS缓冲液，37 ℃孵育8 h。然后离心（8000 r/min，25 ℃，3 min）收集目标菌体。用PBS 缓冲液洗涤3 次后并重悬于1 mL PBS 缓冲液中，并加入60 µL 1 mg/mL PI染液中，置于恒温培养箱中避光孵育（37 ℃，10 min）后离心（8000 r/min，25 ℃，3 min）。PBS 缓冲液洗涤3 次菌体后用酶标仪测荧光强度。

1.2.4 百里香酚和肉桂醛联合处理对沙门氏菌细胞形态的观察

采用扫描电子显微镜考察沙门氏菌外部形态的变化。将沙门氏菌过夜培养至对数期备用。取1 mL 菌液清洗重悬于1 mL 含1/4 MIC 百里香酚+1/4 MIC 肉桂醛，1/2 MIC 百里香酚+1/2 MIC 肉桂醛的TSB 培养基中，37 ℃孵育4 h。然后取出样品洗涤（8000 r/min，25 ℃，3 min）并收集，加入2.5%戊二醛混匀，4 ℃过夜固定。固定后清洗离心（8000 r/min，25 ℃，3 min），按30%、50%、70%、80%、90%、100%的顺序梯度脱水。干燥后镀膜通过扫描电子显微镜观察。

1.2.5 百里香酚和肉桂醛联用在盐焗 鸡中的应用

盐焗鸡工艺流程：冻鲜鸡→解冻→清洗→腌制→烤制→抑菌剂处理→烘干→真空包装→成品。

抑菌剂处理：将烤制后的盐焗鸡置于0.125 mg/mL 百里香酚与0.125 mg/mL 肉桂醛复配的溶液中浸泡10 min，以6.25%（V/V）酒精溶液作为空白组。

将各组样品置于37 ℃贮藏，每组样品各3 个重复，并分别每间隔0、2、4、6、9、15 d 进行以下指标检验。

1.2.5.1 菌落总数的测定

参照GB 4789.2-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》的方法进行鸡肉样品中菌落总数的测定[15]。

1.2.5.2 硫代巴比妥酸反应物（TBARS）的测定

硫代巴比妥酸值的测定参考文献[16]，并略作修改。取10 g 鸡肉样品剪碎，加50 mL 7.5%的三氯乙酸混合液(含0.1% EDTA)，振摇30 min，双层滤纸过滤两次，取5 mL 上清液，加入5 mL 0.02 M TBA 溶液，90 ℃水浴中保温40 min，取出冷却1 h 后离心5 min，上清液中加5 mL 氯仿摇匀，静置分层后取上清液分别在532 nm 比色，记录吸光值，并计算TBA 值。

1.3 数据统计与分析

如无特殊说明，所有样品各重复取3 个，所有实验重复3 次取其平均值。采用SPSS 19.0 和Origin Pro 2017 软件对实验结果进行统计分析并作图，应用单因素方差进行数据统计分析，组间差异采用S-N-K 法，显著性水平p＜0.05。

2 结果与讨论

2.1 百里香酚和肉桂醛联用对沙门氏菌的抑菌活性

通过微量梯度稀释法测定百里香酚和肉桂醛的抑菌活性，如表1 所示，百里香酚和肉桂醛对沙门氏菌的抑菌效果较为明显，二者MIC 均为0.25 mg/mL，MBC 均为0.5 mg/mL，这与Ozogul 等[17]和Wang 等[18]研究的结果相似。百里香酚和肉桂醛对沙门氏菌的FICI 指数为0.75，说明二者具有协同效应，且两者的抑菌效果相当。当0.09 mg/mL 百里香酚和0.09 mg/mL肉桂醛浓度复配时的抑菌效果与0.25 mg/mL 百里香酚、0.25 mg/mL 肉桂醛单独使用时相似。

表1 百里香酚和肉桂醛对沙门氏菌的MIC、MBC 和FICITable 1 The MICs,MBCs and FICI of thymol and cinnamaldehyde against Salmonella

图1 为百里香酚和肉桂醛联用的时间-杀菌曲线。通过图1 可以看出，用1/2 MIC 百里香酚+1/2 MIC 肉桂醛、1/4 MIC 百里香酚+1/4 MIC 肉桂醛处理沙门氏菌时，菌落数比空白组分别减少了1.51 lg(CFU/mL)、0.75 lg(CFU/mL)。而0.5 h 后，1/2 MIC 百里香酚+1/2 MIC 肉桂醛处理组菌落数减少至0；1/4 MIC 百里香酚+1/4 MIC 肉桂醛处理组活菌数上升缓慢，在第8 h时逐渐趋于稳定，和初始值相比增加了 1.08 lg(CFU/mL)，在24 h 时与空白组差值最大为4.2 lg(CFU/mL)。根据Fratini 等[13]及Jacqueline 等[19]的评估方法，1/2 MIC 百里香酚+1/2 MIC 肉桂醛联用对沙门氏菌呈现出协同抑菌效应。多项研究表明，不同植物精油联用可以表现出增效作用，如香芹酚（0.28 mg/mL）与肉桂醛（0.28 mg/mL）联用时对大肠杆菌表现出协同抑菌作用[20]；茶多酚与肉桂精油联用对抑制金黄色葡萄球菌生长具有相加效应[21]。

图1 百里香酚和肉桂醛联用对沙门氏菌的时间-杀菌曲线Fig.1 Time-killing curve of Salmonella exposed to combination of thymol and cinnamaldehyde

2.2 百里香酚和肉桂醛联用对沙门氏菌膜完整性的影响

图2 为荧光倒置显微镜下PI 染料染色后的细胞。菌体在正常状态下细胞膜完整，PI 染料无法进入细胞，菌核无法被染色；而当菌体的细胞膜受损时，PI染料能够较容易穿过细胞膜进而与细胞中的DNA 相结合，菌核可被染色。如图2 所示，空白组中无荧光，菌膜没有被破坏。T1 组处理后出现部分红色荧光，说明在百里香酚和肉桂醛处理下部分菌体着色，部分沙门氏菌的菌膜被破坏，PI 进入细胞与DNA 结合，被激发荧光。T2 组处理后观察到荧光部分面积较大，说明有大量的菌膜受到损伤。结果表明，百里香酚和肉桂醛能够破坏细胞膜，并呈浓度依赖性。

图2 荧光倒置显微镜分析百里香酚和肉桂醛联用对沙门氏菌细胞膜完整性的影响Fig.2 Effect of combination of thymol and cinnamaldehyde on cell membrane integrity of and Salmonellaevaluated by fluorescence microscopy

为了进一步明确百里香酚和肉桂醛联用对细胞膜完整性的破坏程度，对抑菌组处理之后沙门氏菌的荧光强度进行测定。图3 表示不同样品组的荧光强度，不同样品组之间差异性显著（p＜0.05）。由图3 可以看出。空白组的荧光强度为952.67 A.U.，T1 组与T2 组处理沙门氏菌的荧光强度分别是空白组的22.95 倍、26.18 倍。可以看出，空白组的荧光强度远小于处理组。该结果与上述荧光倒置显微镜的结果一致，百里香酚和肉桂醛联用对细胞膜完整性的破坏作用随着质量浓度的增加而增大，且显示出协同破坏性。

图3 百里香酚和桂醛联用对沙门氏菌细胞膜完整性的影响Fig.3 Effect of combination of thymol and cinnamaldehyde on cell membrane integrity of Salmonella

微生物细胞膜的完整性是保证其维持自身新陈代谢等正常生理活动的重要因素[22]。PI 染料穿过细胞膜对DNA 染色实验表明细胞膜完整性的破坏程度，百里香酚与肉桂醛通过破坏微生物细胞膜的完整，影响细胞的正常代谢活动，从而抑制了沙门氏菌的增殖。Wang 等[23]认为，当百里香酚和肉桂醛复配时，可以与位于β-葡萄糖苷酶疏水区附近的氨基酸残基相互作用，从而抑制微生物的正常生长，且浓度越高时，作用效果越明显。申莉莉[24]研究发现百里香酚微胶囊可以破坏金黄色葡萄球菌细胞膜的完整性，从而引起胞内物质泄露。方天夫等[25]研究发现肉桂醛对大肠杆菌细胞膜有着一定的破坏作用，并随着处理浓度增加，破坏效果也越强。

2.3 百里香酚和肉桂醛联合处理对沙门氏菌细胞形态结构的影响

通过扫描电子显微镜观察了百里香酚和肉桂醛联用沙门氏菌形态的影响，结果见图4。从图4 可以看出，未经处理的沙门氏菌表面圆润光滑，菌体结构饱满无褶皱，菌体形态正常；经T1 组处理后，沙门氏菌出现黏连、皱缩、塌陷现象；经T2 组处理后，沙门氏菌出现塌陷、表面轮廓不完整现象，且部分出现折断现象，菌体变形更加严重。上述结果表明，百里香酚和肉桂醛浓度增加，对沙门氏菌的破坏作用逐步增大，使菌体的细胞膜造成破坏和损伤，改变了菌体的正常形态。由此推测出百里香酚、肉桂醛通过破坏细胞膜的完整性，使菌体形态改变，内容物泄露，从而导致菌体死亡。Pasqua 等[26]研究发现通过扫描电镜观察百里香酚、丁香酚、肉桂醛等天然抑菌物质在多种食源性致病菌培养基中细胞膜，可以明显看出细胞膜受到破坏，并出现结构坍塌等现象。

图4 百里香酚和肉桂醛联用对沙门氏菌细胞膜微观结构的影响Fig.4 Effect of combination of thymol and cinnamaldehyde on cell microstructure of Salmonella

2.4 百里香酚和肉桂醛联合处理对盐焗鸡菌落总数的影响

微生物的增殖是引起盐焗鸡腐败变质的最主要因素，可以用来作为预测货架期的主要依据。由图5 可知，空白组初始的菌落总数为1.16 lg(CFU/g)，抗菌剂处理组初始的菌落总数为0.69 lg(CFU/g)。随着储藏时间的延长，空白组和抑菌剂处理组中的菌落总数不断增加。GB 2726-2016规定，盐焗鸡中微生物限量为5.00 lg(CFU/g)。在37 ℃储藏条件下，空白组在第6 d 时菌落总数低于国家食品安全标准限量值，添加抗菌剂组在第14 d 时菌落总数低于国家食品安全标准限量值。空白组在储藏第8d 时菌落总数达到6.03 lg(CFU/g)已超过了国家食品安全标准限量值，而添加抗菌剂组在储藏第16 d 时菌落总数为5.74 lg(CFU/g)，超过国家食品安全标准限量值。空白组在0～8 d 内菌落总数增长快速，与空白组相比，经抑菌剂处理之后的盐焗鸡在0～12 d 菌落总数增长缓慢，12～16 d 菌落总数增长速度逐渐加快，这可能是因为37 ℃适合微生物的增长。而随着储藏时间延长，抑菌剂效果逐渐减弱。上述结果表明，百里香酚和肉桂醛联合处理可以明显抑制微生物生长繁殖，从而达到保鲜效果。其他研究结果表明，百里香酚与肉桂醛在食品应用中能够较好地抑制微生物生长。如，Karam 等[27]研究百里香酚、香芹酚对4 ℃冷藏的腌制生鸡肉货架期的影响，结果表明0.4%香芹酚、0.4%百里香酚可以抑制腌制生鸡肉中腐败菌的生长，并延长其货架期。Anshul 等[28]研究发现卡拉胶、肉桂油和柠檬酸的食用涂层可提高冷藏条件下鸡胸肉的货架期，且采用浸渍法效果较好。

图5 37℃储藏条件下盐焗鸡中菌落总数变化Fig.5 Changes of total number of bacterial colonies in salt-baked chicken under 37 ℃ storage conditions

2.5 百里香酚和肉桂醛联合处理对盐焗鸡TBARS 值的变化的影响

TBARS 值是评估肉制品脂质氧化程度的重要指标，TBARS 值越大表明脂质氧化程度越大，从而导致肉质下降[29]。盐焗鸡在37 ℃储藏期间TBARS 值的变化如图6 所示。空白组与抗菌剂组的初始TBARS 值分别为1.42 mg/kg、1.08 mg/kg。随着储藏时间的延长，空白组和抑菌剂处理组的TBARS值均呈现上升趋势，但空白组的增长速率要高于抑菌剂处理组。由此可见，百里香酚和肉桂醛联合处理能够减缓盐焗鸡脂肪氧化程度，抑制储藏期间TBARS 值的增长速率，从而达到较好的保鲜效果。研究表明，酚类化合物和具有烯醛式结构的物质具有较强的氧化还原性，可以通过清除自由基提高食品的抗氧化能力[18]。因此百里香酚和肉桂醛作为抗氧化剂可减缓盐焗鸡的脂质氧化。在相关的研究中也发现百里香酚和肉桂醛可以减缓其他肉类的脂质氧化程度，Saricaoglu 等[30]研究发现含有百里香精油的蛋白质涂层比没有添加精油的涂层抑制牛肉切片脂质氧化效果更好，添加量为1.0%时具有较明显抗氧化作用。Hussain 等[31]研究发现碎羊肉在4 ℃条件储藏16 d 时，添加0.05%肉桂皮油组TBA 值比空白组降低了1.01 mg/kg，表明肉桂皮油具有延迟脂质氧化的作用。与前述研究相比，百里香酚和肉桂醛联用时添加量明显降低且具有较好的抗氧化作用。

图6 37 ℃储藏条件下盐焗鸡中TBARS 值变化Fig.6 Changes of TBARS of bacterial colonies in salt-baked chicken under 37 ℃ storage conditions

3 结论

3.1 本文选择了百里香酚和肉桂醛两种天然抑菌物质，研究了二者联用抑制沙门氏菌的效果。结果显示百里香酚、肉桂醛对沙门氏菌具有较好的抑菌效果，对沙门氏菌的MIC 均为0.25 mg/mL、MBC 均为0.5 mg/mL；百里香酚和肉桂醛对沙门氏菌的FICI为0.75，表明其对沙门氏菌的抑菌具有协同效应。

3.2 百里香酚和肉桂醛联用的抑菌效应原因：通过百里香酚和肉桂醛联用，加速破坏了沙门氏菌细胞膜的完整性，引起菌体形态结构的改变，使菌体出现塌陷、皱缩现象，扰乱沙门氏菌的正常新陈代谢活动，从而导致其死亡。

3.3 将0.125 mg/mL 百里香酚和0.125 mg/mL 肉桂醛联合应用于盐焗鸡保鲜，较好地抑制了微生物的生长繁殖，在37 ℃储藏条件下显著地抑制盐焗鸡中微生物的生长并延缓了其脂质氧化的速度。空白组和添加抗菌剂组的菌落总数分别在大于第6 d 和第14 d 后开始超过国家食品安全限量标准。

3.4 因此，百里香酚和肉桂醛联用对沙门氏菌具有良好的协同抑菌效应，用于盐焗鸡保鲜达到了较好的效果，百里香酚和肉桂醛联用作为天然复配抑菌剂在盐焗鸡等肉制品保鲜方面具有良好的应用前景。