黄花菜甲醇提取物对糖脂损伤的干涉作用

秦喜悦，张雷，温艳斌，李景明，张雅丽*

（1.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100089）（2.大同市农业农村局，山西大同 037000）

黄花菜（Hemerocallis citrinaBaroni）又名金针菜、萱草花、忘忧草，为百合科阿福花亚科萱草属的一种多年生草本植物，主要种植于中国各地以及日本[1]。中医认为[2]黄花菜具有平肝养血、安神醒脑、消炎止痛、消肿利尿等功能，能治疗耳鸣、心悸不稳、黄疽、痢疾、水肿等多种病症。黄花菜营养丰富，含有维生素、糖类、氨基酸、蛋白质以及无机盐等营养成分。有研究[3]表明黄花菜中占比含量最高的营养成分分别是碳水化合物、蛋白质以及脂肪，它们的占比含量分别为60%、14%和2%，此外还含有60 余种挥发性物质，其中醇类6 种（28.06%），醛类6 种（11.86%），酮类10 种（14.34%），酯类3 种（4.85%），烷烃类8种（7.12%），烯烃类6 种（7.47%），羧酸类9 种（16.00%），酚类3 种（2.10%），其他9 种（8.19%）。黄花菜的活性功能主要表现在抗抑郁[4-6]、降血脂[7,8]、降血糖[9]、抗肿瘤[10,11]、抗氧化[12,13]、抑菌[14,15]等方面。目前黄花菜活性功能成分的常用提取方法是溶剂萃取法[16]，但该法的提取溶剂会造成污染，容易对后期的实验造成影响，因此常采取一些辅助手段如超声、微波等[17]，起到破坏植物细胞壁，促使功能成分尽快、尽量多溶出的作用。

糖脂代谢紊乱疾病是指由于机体长期处于高糖、高脂环境下，体内糖、脂代谢发生异常，并对机体健康造成损坏，从而导致一系列慢性疾病的发生，如高血压、高血脂、糖尿病、心脑血管疾病等[18-20]。目前，我国心血管疾病死亡率居于首位[21]，此外，预计到2045 年全球糖尿病患者将达到6.29 亿人[22]，糖脂代谢紊乱所带来的人体健康问题日益严重。近年来，天然植物由于其生物活性物质的高效性和低毒性，在开发新药等方面取得重要进展与认可[23]，国内外学者正在积极寻找干涉和治疗糖脂紊乱的天然植物。

本研究利用超高效液相色谱串联三重四极杆质谱法（Ultra performance liquid chromatography tandem triple quadrupole mass spectrometry，UPLC-QQQ-MS/ MS）分析了黄花菜甲醇提取物中的成分，并以秀丽线虫为基础，对糖脂损伤模型喂食不同浓度的黄花菜甲醇提取物，观察其产卵量、身长及寿命表型，深入探讨黄花菜甲醇提取物对秀丽线虫糖脂损伤的干涉作用，对于综合开发利用黄花菜资源具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄花菜，山西省大同市；秀丽隐杆线虫（C.elegans BristolN2），由美国CGC（Caenorhabditis Genetics Center）提供；线虫的培养采用线虫生长培养基（NGM），以Escherichia coli strainOP 50 为食物饲喂，在22 ℃恒温培养箱中培养。

甲醇、甲酸、正己烷、乙酸铵（色谱级），德国Merek Millipore 公司；蔗糖、硬脂酸、胆固醇、琼脂、酵母浸粉、胰蛋白胨（生物级），蓝博立德试剂公司。莨菪亭标准品：芦丁、金丝桃苷、绿原酸、槲皮素、柯伊利素、芹菜素、莨菪亭、槲皮素、异鼠李素、花旗松素、原儿茶素、对香豆酸、龙胆酸、咖啡酸，所有标准品纯度＞97%（质量百分数），麦克林公司。

1.2 仪器与设备

中药粉碎机，江阴万通药化器械有限公司；RV10旋转蒸发仪，德国IKA 公司；ALPHA 1-4 真空冷冻干燥机，德国Christ 公司；SCQ-3201 超声波清洗机，上海声彦超声波有限公司；TQ-S 超高效液相色谱联用仪，美国Waters 公司；3-30k 高速冷冻离心机，Sigma-Aldrich（上海）贸易有限公司；SZ66013ZL 体视镜，重庆奥特光学仪器有限责任公司；SHP-80 生化培养箱，上海培因实验仪器有限公司；THZ-C 恒温振荡箱，太仓市实验设备厂；DL-CJ-FND-∏超净台，北京东联哈尔仪器制造有限公司。

1.3 黄花菜甲醇提取物的制备及成分分析

将黄花菜样品干燥制成粉末，过100 目筛。取黄花菜样品20 g，分散于500 mL 甲醇（80%）溶液中，超声萃取20 min 后，经7000 r/min 离心10 min，收集上清液，重复上述步骤3 次使上清液基本呈无色。合并上清液，减压浓缩后冷冻干燥得到黄花菜甲醇提取物，并用于后续实验。

取黄花菜样品0.2 g，分散于5 mL 甲醇（80%）溶液中，并加入低中高三个浓度的莨菪亭标准品，超声萃取20 min 后，经7000 r/min 离心10 min，收集上清液。重复上述步骤3 次使上清液基本呈无色，合并上清液，定容至25 mL。取10 mL 定容后的上清液，加入10 mL 正己烷，剧烈震荡后静置10 min，弃去上层液体，重复步骤使上层液体无色。取稀释50 倍的黄花菜甲醇提取物样液0.9 mL 分别与0.1 mL，100 ng/mL 的大豆苷元二级标准液混合，过0.22 μm 滤膜后进样。利用UPLC-QQQ-MS/MS 对黄花菜甲醇提取物进行成分分析。

1.4 秀丽线虫糖脂损伤模型的构建

分别挑取同期化后的L1 期秀丽线虫幼虫于含有100 µmol/mL 蔗糖和100 µg/mL 硬脂酸的培养基中，每天观察其寿命、身体长度和产卵量的情况并准确记录。

1.5 黄花菜甲醇提取物对普通秀丽线虫及糖脂损伤模型的影响

将黄花菜甲醇提取物分别配成质量浓度为0、400、800、1200 μg/mL 的稀释液，做如下秀丽线虫实验。

1.5.1 秀丽线虫寿命的测定

挑取同期化后的L1 期秀丽线虫幼虫于添加了相应大肠杆菌OP50 的NGM 上，之后每天将培养基中活着的秀丽线虫转移至新培养基中培养，计数每天秀丽线虫存活数量，直至全部死亡，计每组线虫存活天数的平均数为平均寿命。每组20 条线虫，重复三次。

平均寿命的计算公式如下：

式中：

T：每条线虫的存活天数，d；

D：线虫总条数。

式中：

S：实验组平均寿命，d；

K：空白组平均寿命，d。

1.5.2 秀丽线虫身长的测定

挑取同期化后的秀丽线虫幼虫于相应的NGM中，在体式显微镜下，转动培养皿，使秀丽线虫的身体与标尺刻度尽可能重合，读取其身长度格数，按照标尺与实际长度的比例换算得到秀丽线虫实际身长。线虫同期化当天记为第0 d，记录线虫身体长度，直至第6 d。每组10 条线虫，重复三次。

1.5.3 秀丽线虫产卵量的测定

线虫同期化当天记为第0 d，挑取L1 期幼虫至已添加相应大肠杆菌OP50 的NGM 上，当秀丽线虫长至L4 期时，将每条L4 期线虫置于一个培养板上单独培养。每天将该线虫转移至新NGM 上，直到其产卵结束。每次转移后，清点旧培养基上子代的数量。每组10 条线虫，重复三次。

1.6 数据统计

本实验数据使用SPSS 19.0软件进行统计学分析，采用ANOVA 模块中的LSD 和Duncan’s Test 分析比较组间差异，p＜0.05 为差异显著。采用Origin Pro 8.5作图，以平均值±标准差表示。

2 结果与讨论

2.1 黄花菜甲醇提取物的成分分析

本研究使用80%的甲醇通过超声萃取对黄花菜进行提取，并利用UPLC-QQQ-MS/MS 对黄花菜甲醇提取物进行成分分析，分析结果如表1 所示，黄花菜甲醇提取物中含有芦丁、绿原酸、槲皮素、咖啡酸、原儿茶素、对香豆酸、异鼠李素、花旗松素、龙胆酸等成分。其中，芦丁含量最高，为5721.11 ng/mg。

表1 黄花菜甲醇提取物的成分与含量Table 1 The content in methanol extract of Hemerocallis citrina Baroni

2.2 黄花菜甲醇提取物对普通秀丽线虫的影响

普通秀丽线虫喂食不同浓度黄花菜甲醇提取物后的寿命情况如图1a与表2 所示，与空白组相比，喂食400 µg/mL、800 µg/mL 黄花菜甲醇提取物对普通秀丽线虫的平均寿命无明显作用，Vc 阳性对照组也没有明显提高的作用；而喂食1200 µg/mL 黄花菜甲醇提取物对普通秀丽线虫的平均寿命却有降低作用，其生存率也一直低于空白组，说明高浓度的黄花菜甲醇提取物会对普通秀丽线虫造成一定程度的损伤。

表2 不同黄花菜甲醇提取物浓度下的普通秀丽线虫平均寿命Table 2 The mean lifespan of normal C.elegans with different concentrations of methanol extract of Hemerocallis citrina

身长情况如图1b 所示，在第1～3 d 快速生长期时，不同浓度的黄花菜甲醇提取物对普通线虫身长无明显作用；在第4 d 时，与空白组相比，喂食400 µg/mL、800 µg/mL、1200 µg/mL 黄花菜甲醇提取物对普通秀丽线虫的身长均有显著提高作用，分别提高了4.40%、7.73%、10.51%，Vc 阳性对照组提高了11.27%；在第5 d 时，喂食800 µg/mL、1200 µg/mL 黄花菜甲醇提取物对普通秀丽线虫的身长仍有显著提高作用，与空白组相比分别提高了5.39%、4.99%，Vc 阳性对照组提高了3.14%；但在第6 d 进入衰老期后，线虫身长缩短，各实验组之间并没有显著差异。由此表明，喂食400 µg/mL～1200 µg/mL 范围内的黄花菜甲醇提取物在一定程度上可以增强普通秀丽线虫的最大身长，对线虫的生长发育有一定的影响。

子代情况如图1c、d 所示，由图1c 可知，在第2～6 d 产卵期时，普通秀丽线虫在喂食不同浓度黄花菜甲醇提取物后其子代随时间呈现先增高后减少的趋势，且产卵高峰期主要集中在第3 d 和第4 d。由图1d 可知，与空白组对比，普通秀丽线虫在喂食800 µg/mL、1200 µg/mL 黄花菜甲醇提取物后其总子代数提高了24.76%、50.82%，Vc 阳性对照组提高了5.70%。由此表明，800 µg/mL～1200 µg/mL 范围内的黄花菜甲醇提取物可以显著提高普通秀丽线虫的生殖能力。

图1 黄花菜甲醇提取物对普通秀丽线虫的影响Fig.1 Effect of methanol extract of Hemerocallis citrina Baroni on common C.elegans

2.3 黄花菜甲醇提取物对糖损伤秀丽线虫模型的影响

为研究黄花菜甲醇提取物是否对糖损伤的线虫有干涉作用，给线虫喂食100 µmol/mL 蔗糖造成线虫在高糖饲喂情况下寿命和生长发育指标（身长、产卵量）的改变，同时，添加不同浓度的黄花菜甲醇提取物进行干涉实验。糖损伤秀丽线虫喂食不同浓度黄花菜甲醇提取物后的寿命情况如表3与图2a 所示，与普通秀丽线虫平均寿命9.38 d 相比，糖损伤线虫平均寿命为8.05 d，降低了14.18%。喂食400 µg/mL、800 µg/mL、1200 µg/mL 黄花菜甲醇提取物可显著提高糖损伤线虫的平均寿命，与未添加提取物的糖损伤线虫相比分别提高了9.69%、24.47%、22.73%，Vc 阳性对照组也提高了25.47%。与普通秀丽线虫相比，黄花菜甲醇提取物干涉的糖损伤秀丽线虫的平均寿命获得了明显的提高，甚至超过普通线虫添加黄花菜甲醇提取物的平均寿命，但由图2a 可知，平均寿命的增加主要归因于第5～10 d 线虫生存率的提高，而不是线虫最长生存天数的提高。

表3 不同黄花菜甲醇提取物浓度下的糖损伤秀丽线虫平均寿命Table 3 The mean lifespan of sugar-damaged C.elegans with different concentrations of methanol extract of Hemerocallis citrina Baroni

身长情况如图2b 所示，与图1b 相比，糖损伤线虫在生长发育上受到了抑制，普通线虫第2 d 的身长约为0.62 mm，100 µmol/mL 蔗糖会导致线虫生长缓慢，第2 d 的身长只有0.56 mm，而添加400 µg/mL、800 µg/mL、1200 µg/mL 黄花菜甲醇提取物则均可显著改善糖损伤秀丽线虫的身长情况。线虫在第5 d 时身长达到最大，与普通线虫相比，糖损伤线虫最大身长没有明显变化（都在1.35 mm 左右），添加不同浓度的黄花菜甲醇提取物在此指标上也没有明显作用。

子代情况如图2c、d 所示，由图2c 可知，喂食不同浓度黄花菜甲醇提取物后，糖损伤秀丽线虫在第2 d几乎不产卵，与图1c 比较可知其产卵期推迟了1 d，产卵总量降低了40.13%。在第3～6 d 产卵期时，糖损伤线虫的产卵高峰期也延长到第4 d 至第5 d，而添加不同浓度黄花菜甲醇提取物后产卵高峰主要集中在第4 d。由图2d 可知，喂食400 µg/mL、800 µg/mL、1200 µg/mL 浓度的黄花菜甲醇提取物后，对糖损伤秀丽线虫的生殖能力具有一定的修复作用，其产卵总量分别提高了2.74%、3.40%、3.88%，Vc 阳性对照组提高了2.91%。

图2 黄花菜甲醇提取物对糖损伤秀丽线虫模型的影响Fig.2 Effect of methanol extract of Hemerocallis citrina Baroni on sugar-damaged C.elegans

2.4 黄花菜甲醇提取物对脂损伤秀丽线虫模 型的影响

脂损伤线虫喂食不同浓度黄花菜甲醇提取物后其寿命情况如表4 和图3a 所示，空白组为未喂食黄花菜甲醇提取物的脂损伤线虫，其平均寿命为9.02 d，与普通秀丽线虫寿命相比缩短了3.94%。添加不同浓度的黄花菜甲醇提取物后，不同程度地延长了线虫的平均寿命。其中，添加1200 µg/mL 黄花菜甲醇提取物的脂损伤线虫的平均寿命天数为11.73 d，与脂损伤空白组线虫相比提高了30.04%，Vc 阳性对照组提高了8.43%。由图3a 可知，黄花菜甲醇提取物的添加，不但显著提高了产卵后线虫的生存率，而且使线虫的最大寿命也提高至27 d。另外，高脂饲喂还引发了线虫在发育阶段（0～3 d）生存率的降低，而添加低浓度 黄花菜甲醇提取物对此指标影响不明显，但中高浓度黄花菜甲醇提取物能够很好地回复线虫在发育阶段的生存率，Vc 效果介于二者之间。

表4 不同黄花菜甲醇提取物浓度下的脂损伤秀丽线虫平均寿命Table 4 The mean lifespan of stearic acid-damaged C.elegans with different concentrations of methanol extract of Hemerocallis citrina Baroni

身长情况如图3b 所示，与图1b 相比，脂损伤秀丽线虫的身长在各阶段无明显差别。但在添加黄花菜甲醇提取物后，脂损伤线虫的身长发生了一定程度的增加，在第2 d 时，喂食1200 µg/mL 浓度的黄花菜甲醇提取物的脂损伤秀丽线虫的身长比未添加组提高了10.36%，第4 d 时提高了7.81%；但第5 d 时1200 µg/mL 浓度的黄花菜甲醇提取物却加剧了脂损伤秀丽线虫的身长的缩短，推测可能脂损伤线虫产卵后身体机能变得脆弱，不能耐受高浓度的黄花菜甲醇提取物。Vc 阳性对照组能够转变高脂饲喂对线虫身长的影响，较大程度地提高了线虫发育期身长（第2 d 提高了17.08%）以及最大身长（第4 d 提高了13.39%）。

子代情况如图3c、d 所示，与图1c、d 普通秀丽线虫空白组的产卵总量相比可知，脂损伤秀丽线虫的产卵总量下降了73.88%，且第2 d 基本不产卵。添加不同浓度的黄花菜甲醇提取物后，脂损伤线虫第2 d恢复了少量的产卵，且400 µg/mL、800 µg/mL、1200 µg/mL 浓度的黄花菜甲醇提取物都对脂损伤秀丽线虫的产卵总量有显著的干涉作用，分别提高了83.32%、84.94%、97.32%。Vc 阳性对照组无论在恢复线虫早期产卵还是总产卵量方面，都比黄花菜甲醇提取物有更好的效果。

图3 黄花菜甲醇提取物对脂损伤秀丽线虫模型的影响Fig.3 Effect of methanol extract of Hemerocallis citrina Baroni on stearic acid-damaged C.elegans

秀丽线虫从卵孵化后第0～3 d 是生长发育最快的时期，也是身长变化最大的时间段，其在第3 d 左右进入产卵期，一般产卵高峰期在第4 d，基本结束于第6 d[24-27]。普通秀丽线虫的产卵总量在150～180 个/条，最长寿命约为15～22 d[28-31]。在本实验中，对普通秀丽线虫饲喂不同浓度的黄花菜甲醇提取物后，能够显著提高线虫的生殖（产卵数量）和发育（身长）指标，尤其高浓度的黄花菜甲醇提取物能够使得线虫的产卵量达到230 个/条，说明黄花菜甲醇提取物可能在生殖功能上发挥作用，李云霞[32]研究发现黄花菜中的黄酮类化合物能够显著增加性未成熟的小鼠子宫的湿重和子宫系数，迅速提升小鼠血清中的雌激素水平，表明黄花菜中的黄酮类化合物对于机体内雌激素的调节具有一定作用。秀丽线虫在产卵后会发生身长的缩短和死亡率的提升，而且总产卵量与寿命呈现负相关性[33,34]，本实验中，高浓度的黄花菜甲醇提取物极显著地提高了线虫的产卵量，但其生存率在产卵后急速下降，同时平均寿命也出现了缩减。

高浓度蔗糖处理秀丽线虫会引起幼虫生长阻滞，发育迟缓；同时，高浓度蔗糖也会改变线虫培养基的渗透压，加剧线虫应对外界氧化应激的压力[24]。本实验中，100 µmol/mL 蔗糖导致线虫发育阻滞、产卵量下降、平均寿命和最长寿命都显著缩短。在给予不同浓度的黄花菜甲醇提取物后，虽然对糖损伤线虫的生殖和发育指标只有较小的干涉回复作用，但在平均寿命方面表现出了非常显著的正向回复作用，尤其对产卵后线虫（5～10 d）的生存率明显提升，且此提升效果随黄花菜甲醇提取物添加浓度的提高而增加。在添加100 µg/mL 硬脂酸后，线虫出现了产卵量和平均寿命下降的现象，这与之前的报道类似[24]。给予黄花菜甲醇提取物进行干涉后，极显著地回复了线虫的产卵能力及生存率，且效果都随黄花菜甲醇提取物添加浓度的提高而增加。糖脂代谢紊乱会使机体产生大量自由基，主要以氧自由基为主，这些自由基会导致机体激烈的氧化应激反应，而过多的活性氧会破坏大多数生物分子的结构，如构成细胞膜的脂质和蛋白质以及细胞核内的遗传物质DNA 等，甚至还会干扰人体的正常生命代谢活动，降低机体免疫功能，引起疾病，加速人体衰老进程[26,27]。Suresh 的研究表明[35,36]，黄花菜中提取的多酚类物质，具有很强的抗氧化活性（清除DPPH 自由基、ABTS 自由基、H2O2、磷钼检测和还原能力），以及抗革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，可作为抗菌类、抗氧化与糖尿病生物药物的天然来源。Wang 等[12]利用UPLC-PDA/MS 分析鉴定了黄花菜中17 种黄酮类化合物，并发现其能通过抗氧化和抗凋亡途径有效保护BRL-3A 细胞免受t-BHP 诱导的氧化应激损伤，并显著降低活性氧积累。潘炘[37]研究发现黄花菜中含有槲皮素、芦丁、阿魏酸等多酚，其提取物的金属离子螯合能力、清除自由基与超氧阴离子能力、还原能力都较为显著，还可以有效减低小鼠体内丙二醛的含量，增强超氧化物歧化酶的表达。由此推测，黄花菜甲醇提取物对糖脂损伤秀丽线虫生殖能力、生长发育以及寿命的干涉作用可能与降低其体内的氧化应激反应有关。

3 结论

本研究利用UPLC-QQQ-MS/MS 对黄花菜甲醇提取物中的成分进行了定性、定量分析，测得黄花菜甲醇提取物含有槲皮素、异鼠李素、花旗松素、原儿茶素、芦丁、对香豆酸、龙胆酸、绿原酸、咖啡酸等9种物质，其中，芦丁含量最高。通过对普通秀丽线虫、糖损伤秀丽线虫、脂损伤秀丽线虫三种模型的秀丽线虫喂食不同浓度的黄花菜甲醇提取物，并与空白组和Vc 阳性对照组对比，评价黄花菜甲醇提取物对三种不同模型的秀丽线虫的干涉作用。结果表明，对普通秀丽线虫，800 µg/mL～1200 µg/mL 浓度的黄花菜甲醇提取物对其最大身长有一定的增强作用，且可以明显增强其生殖能力；对糖损伤秀丽线虫，400 µg/mL～1200 µg/mL 浓度的黄花菜甲醇提取物对其生殖能力有一定的干涉作用，可以显著延长其平均寿命，且随浓度增高呈现先增加后减少的趋势；对于脂损伤秀丽线虫，400 µg/mL～1200 µg/mL 浓度的黄花菜甲醇提取物对其生殖能力、身长和寿命都有显著的干涉作用，且对生殖能力与平均寿命的干涉作用都随浓度升高而增强。未来可继续深入探究黄花菜甲醇提取物的对糖脂损伤的干涉作用机理和抗氧化功能，为黄花菜甲醇提取物功能性食品的开发提供理论支撑。