鱼腥草多酚对葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导小鼠溃疡性结肠炎的改善作用

董晶，王帅珂，吴苹，王硕，刘晋倩，冀芦沙，陈芳*

（1.聊城大学药学院，山东聊城 252000）（2.聊城市人民医院，转化医学研究联合实验室，山东聊城 252000）

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC），其发病特征以结肠粘膜下层溃疡以及炎症为主，是一种常见的炎症性肠炎。近几年，UC 的发病率在发展中国家逐年上涨[1]。UC 发病机制及病因与多种因素有关：病理学因素、遗传因素、药物因素以及生活方式的改变，如饮食习惯、吸烟、压力和缺乏锻炼等。研究发现UC 黏膜炎症以嗜酸性粒细胞和中性粒细胞浸润为主要特征。报告显示，UC 可能与肝肠病变相互关联[2-3]。“肠-肝轴”的概念由Marshal 等人[4]于1998 年提出，肝脏和肠道通过门静脉和胆管相互关联[5]。当长期接触酒精或饮用大量葡聚糖硫酸钠（DSS）溶液可导致肠道屏障受损，肠源性内毒素经过受损的肠粘膜移位至肝脏与内毒素蛋白、分化簇14 结合，激活NF-kappaB 炎症信号通路，产生肿瘤坏死因子（TNF-α）和趋化因子等多种炎症因子，最终造成肝损伤。肝脏损伤程度与肠道损伤程度呈正相关，这可能成为UC 发病机制过程中的重要环节[6-8]。

DSS 是一种化学药物诱导模型，其具体的诱导机制仍不明确，但通常认为与肿瘤坏死因子、IL-6、干扰素等相关，是目前肠炎造模最常用的方式。研究发现，肠道促炎细胞因子包括肿瘤坏死因子TNF-α、白细胞介素（IL-1β）和抗炎因子IL-10 等与UC 的发生密切相关。肠道细胞炎症因子的长期浸润使结肠部位病变。因此，治疗UC的关键是调节肠道炎症因子、抑制肠道炎症反应[9]。

溃疡性结肠炎可致患者生活痛苦不堪，严重可引起肝肾器官损伤等并发症。近年来，我国西药治疗UC取得了一定的疗效，但仍存在较多的不良反应。中医治疗具有一定的优势，在我国中医理论中UC 的临床表现归属“泄泻、久痢、肠风、脏毒”的范畴。鱼腥草（Houttuynia cordata，HC）富含多种营养物质，药用食用价值较高，味辛，性微寒，具有清热解毒、抗病毒等作用[10]。HC 种植成本低廉、几乎无毒副作用、药用价值高且广泛。多酚是一类植物次生代谢产物，广泛分布于自然界中，具有抗氧化[11]、抗菌消炎[12]、护肝和提高免疫力等功效[13]。诸多研究显示，鱼腥草中富含多酚类物质，且具有较强的活性，可用于临床和医学研究[14-15]。提示鱼腥草多酚具有潜在的治疗UC的功效。本研究将探讨鱼腥草多酚对UC 小鼠的保护效果及可能的抗炎机制，以期为UC 临床抗炎药物的研发提供一定的理论基础和治疗手段。

1 材料与方法

1.1 实验动物

KM 小鼠，体重18～22 g，雄性。购自：济南朋悦实验动物繁育有限公司，动物生产许可证号（SCXK鲁20140007）。

1.2 主要试剂与仪器设备

鱼腥草提取物（产品规格为10:1），西安瑞林生物科技有限公司；葡聚糖硫酸钠盐，Sigma-Aldrich；血清丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、血尿素氮（BUN)、血肌酐（Cr），碧云天生物技术有限公司；白细胞介素6（IL-6）、白细胞介素1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）ELISA 试剂盒，碧云天生物科技有限公司。高速冷冻离心机，Eppendorf 公司；电子恒温水浴锅，上海优浦科学仪器有限公司；MK酶联免疫检测仪，Thermo 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 鱼腥草中总酚含量测定

本实验采用优化的三氯化铁-铁氰化钾方法，测定HC 多酚含量，以没食子酸为对照品，配制不同浓度的没食子酸标准溶液，于760 nm 处测定溶液吸光值，绘制标准曲线进行含量测定。以没食子酸浓度（μg/mL）为横坐标，吸光度值（A）为纵坐标，绘制标准曲线。线性方程为y=0.1521x+0.0072，r=0.9989，结果表明没食子酸在0.31～0.94 μg/mL 范围内线性关系良好。取适量待测样品置于10 mL 容量瓶中，加入0.3%的十二烷基硫酸钠，加入铁氰化钾溶液与铁氰化钾混合溶液（1:1）1.5 mL，混匀，于暗处放置20 min，760 nm 处测定溶液吸光值，代入标准曲线中，计算多酚含量[16]。

1.3.2 动物分组与造模

适应性喂养3 d，随机分为5 组，鱼腥草多酚低、中、高剂量组，空白对照组、模型组（n=10）。空白组给予无菌水，模型组和鱼腥草多酚组自由饮用0.4 mL 3.5%的DSS 溶液9 d（开始给予DSS 为实验第4 d），造模后，鱼腥草多酚组分别按照低、中、高剂量（40 mg/kg、60 mg/kg、100 mg/kg）进行药物灌胃处理，每日一次共10 d。每日称重并观察小鼠进食变化，粪便情况（收集粪便）。给药结束3 d 后，麻醉并解剖小鼠，通过摘取眼球从每只小鼠采集约1 mL 血液，分离血清于-20 ℃保存。沿腹腔中线打开腹腔，分离结肠和肝肾，测量、观察、称重于-80 ℃冰箱保存样品备用。

1.3.3 疾病活动指数（Disease activity index，DAI）评分

DAI 评分包括：动物体重下降数值、动物粪便粘稠度、动物粪便隐血情况，可以比较直观的反映动物建模是否成功。DAI 评分范围为0～12 分[17]，评分按照严重程度划分为：体重下降（0～4 分）；腹泻情况（0～4分）；出血情况（0～4 分）。

1.3.4 组织病理学检查

解剖小鼠后，取结肠组织，使用10%的中性甲醛溶液固定24 h，乙醇梯度洗脱（70%、85%、95%、100%的酒精），石蜡铺好后切成片（厚度为4 µm），二甲苯脱蜡，依红染色，乙醇洗脱，二甲苯澄清，封片。光镜观察形态学变化。

1.3.5 酶联免疫法测定结肠中细胞因子TNF-α、IL-6、IFN-γ、IL-1β

取适量动物结肠标本约80 mg，冰水浴中制备5%的组织匀浆液，采用Bradford 法测组织总蛋白浓度。按照酶联免疫吸附制造商说明书测定炎症因子浓度，450 nm 处测定标准品和样品吸光值，绘制标准曲线。

1.3.6 小鼠血清中AST、ALT、Cr 和BUN 水平测定

使用全自动生化分析仪检测动物血清，按说明步骤操作，实验设立对照组孔、模型组孔、多酚组孔，每组四个重复，绘制标准曲线，测得AST、ALT、Cr、BUN。

1.3.7 统计学分析方法

数据来自至少3个独立实验，采用GraphPad Prism 5.0 程序进行单因素方差比较，数据以平均值±标准偏差（Mean±SD）呈现。p＜0.05，具有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 HC 多酚含量测定

多酚类物质存在于多种植物中，具有抗炎、抗病毒、保护神经等多种生物活性，多酚物质作为鱼腥草中的活性成分，其含量测定在鱼腥草药材的质量控制中具有重要意义。文献报道，鱼腥草叶片中含丰富的多酚类物质[18]，本实验以鱼腥草叶片纯提取物为原料，采用分光光度法，按照标准曲线步骤反应后，测得吸光值，将实验结果换算为每克鱼腥草纯提取物中含有的多酚相当于没食子酸的毫克数（mg/g），测得HC 多酚平均含量为22.80 mg/g，与文献报道结果一致[19]。

2.2 HC 多酚对小鼠体重的影响

实验中观察发现，模型组大部分小鼠第5 d 时开始同时出现稀便，第6～7 d 出现不同程度的便血。该实验结果表明3.5%的DSS 可以成功诱导肠炎模型的建立，以体重减轻、腹泻等为主要特征。如图2 所示，给予DSS 溶液后第7 d，除空白组外，各组小鼠体重均呈下降趋势：DSS 组下降了6.12%、低剂量组下降了6.01%、中剂量组下降了5.83%、高剂量组下降了6.24%。在造模第10 d，经过不同剂量鱼腥草多酚药物干预后，实验小鼠体重情况如下：DSS 组下降了12.03%、低剂量组增加了6.07%、中剂量组增加了10.02%、高剂量组增加重了13.04%（p＜0.01）。上述数据表明，鱼腥草多酚可以改善小鼠结肠炎所导致的体重下降，且各剂量组间呈剂量依赖性。

图2 HC 多酚对小鼠体重影响Fig.2 The effects of total polyphenol from Houttuynia cordata on body weight in mice with colitis (Mean±SD,n=10)

2.3 HC 多酚对小鼠DAI 评分和结肠外观的影响

实验记录发现空白组小鼠，动作灵活，毛发顺滑，粪便正常，精神状况正常；模型组小鼠可见动作反应迟缓，饮水和进食量锐减，且大多呈蜷缩状，大便不成形，肛周粘有稀便。模型组小鼠肠壁明显增厚，溃疡面有深褐色坏死物附着，肠管段狭窄严重粘连，充血水肿较明显，肠壁变薄且不易分离（图3b)。各治疗组小鼠肠管有不同程度的点状或节段性黏膜充血，严重程度较模型组减轻。模型组小鼠在给予DSS 溶液饮水第3～4 d，DAI 评分显著升高；经过鱼腥草多酚干预第10～12 d，DAI 评分较空白组分别降低了26.83%、41.46%、54.46%（p＜0.01)；多酚剂量组结肠分别平均增加了2 cm、3.17 cm、4.52 cm，且肠肌层比较完整。结果表明，鱼腥草多酚可以降低DAI 评分，改善DSS 所致的腹泻和便血情况。

图3 HC 多酚对小鼠DAI 评分和结肠外观的影响Fig.3 The effects of total polyphenol from Houttuynia cordata on DAI score and colonic appearance in mice with colitis(Mean±SD,n=10)

2.4 HC 多酚对小鼠结肠组织病理学的影响

组织病理学染色结果直接表明DSS 成功诱导了小鼠溃疡性结肠炎（图4）。模型组小鼠肠粘膜组织结构受损，粘膜内外壁厚薄不均，结肠腺体变形粘膜，内层严重溃疡及糜烂面形成；相反，空白组小鼠肠粘膜完整，上皮细胞致密且排列有序，内层无溃疡面。多酚低剂量组切片上存在着少量的溃疡面且黏膜外壁不完整，相比模型组有一定程度的减轻；多酚中剂量组组织结构较完整，仍存在轻微溃疡面；多酚高剂量组结肠切片上溃疡面不明显，几乎无炎症细胞浸润，可趋近于正常组的状态。HC 活性成分显著减弱了结肠病理变化，可以减轻DSS 诱导的炎症细胞浸润。

图4 小鼠结肠组织H&E 染色Fig.4 Colon histopathology analysis

2.5 HC 多酚对UC 小鼠结肠长度/重量的影响

如表1 所示，模型组小鼠结肠平均长度为6.35 cm，空白组长度为11.63 cm，DSS 灌胃处理后结小鼠结肠缩减至6.35 cm，较空白对照组相比缩短了45.50%（p＜0.05）。通过灌胃给予鱼腥草多酚药物干预后，模型组小鼠结肠长度增加明显[20]。经多酚各剂量组干预后的小鼠结肠平均长度为8.35 cm、9.52 cm、10.87 cm，分别增加了23.02%、33.33%、41.60%。结肠重量方面，DSS 组小鼠结肠重量较照组增加了49.40%（p＜0.05），药物治疗中、高剂量组平均重量为241.93 mg、232.65 mg，分别减少了25.60%、28.40%。低剂量组平均重250.35 mg，仅能减少22.80%。治疗组间相比，多酚高剂量组治疗效果优于其余两组。模型组的结肠重量长度比显著增加至 51.01 cm（p＜0.05），结果显示，HC 多酚可以改善DSS 引起的结肠缩短和肠重增加，且具有统计学意义。

表1 HC 多酚对UC 小鼠的结肠长度、重量的影响Table 1 Effects of polyphenol from Houttuynia cordata on colon length and colon weight in UC mice (Mean±SD,n=10)

2.6 HC 多酚对UC 小鼠肝肾指数影响

分别计算小鼠肝指数（肝重/体重×100%）、肾指数（肾重/体重×100%），如表2 所示，不同剂量药物治疗组肝脏均重为1.46 g、1.36 g、1.32 g，肝指数分别为4.31%、4.18%、4.10%，变化不明显；模型组小鼠肝肾平均重量：1.51 g、0.55 g与空白组比较，分别增加了17.92%、19.63%。模型组与空白组小鼠重量比较明显加重，说明通过DSS 造模不仅使小鼠肠道受损还造成一定肝脏损伤。提示饮用DSS 会损伤肠粘膜，肠内容物通过门静脉进入肝脏，进而使肝指数增加。

表2 HC 多酚对UC 小鼠的肝肾指数的影响Table 2 Effects of polyphenol from Houttuynia cordata on liver and kidney index in UC mice (Mean±SD,n=10)

2.7 HC 多酚对小鼠炎症因子的影响

IL-lβ是一种促炎性细胞因子，可激活多种炎症细胞[21]。TNF-α是机体免疫应答和炎性反应的重要调节因子，可促进肠道上皮细胞凋亡，参与UC 炎性反应的发生[22]。如表3 所示，DSS 显著增加了炎症因子浓度，与空白组比较差异极显著（p＜0.01），DSS 模型组小鼠结肠组织中TNF-α含量较正常组增加了6 倍、IL-1β增加了7 倍、IL-6 增加了10 倍、IFN-γ增加了6倍（p＜0.05）。给予药物干预后，小鼠HC 多酚低、中、高各剂量组TNF-α水平分别降低了10.92%、48.24%、56.27%；IL-1β水平降低了59.14%、62.57%、70.1%；IL-6 水平降低了67.55%、49.25%、56.13%；IFN-γ水平降低了44.90%、74.05%、76.50%，与Lee 等[23]的研究结果一致，鱼腥草提取物抑制了TNF-α、促炎因子白细胞介素的生成。

表3 小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6 和IFN-γ 浓度Table 3 Comparison of concentrations of TNF-α,IL-1β,IL-6,and IFN-γ in serum (Mean±SD,n=10)

表4 模型组动物血清中血清丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶的表达水平分别为156 U/L、56 U/L，与空白组比较明显升高了20.51%、42.86%（p＜0.05）；观察给药组中、高剂量小鼠AST、ALT 水平，明显低于DSS 模型组（p＜0.05）且优于低剂量组；而模型组小鼠的血尿素氮（BUN）、血肌酐（Cr）水平为10.48 U/L、68.27 U/L，较空白组分别增加了26.62%、40.72%。多酚高剂量组Cr、BUN、AST、ALT 水平显著低于模型组（p＜0.05）。以上结果表明，HC 提取物多酚不仅可以抑制UC 小鼠肠道炎症因子的生成，且对DSS 诱导的肝肾指标的上升具有一定调节作用。

表4 小鼠血清中AST、ALT、CR 和BUN 水平Table 4 Comparison of concentrations of AST,ALT,CR and BUN in serum (Mean±SD,n=10)

3 讨论

大量研究表明多酚具有抗炎作用：蓝莓果实多酚提取物能够抑制LPS（脂多糖）诱导的RAW264.7 巨噬细胞炎症反应，减少NO 的分泌，下调炎症因子[24]；黑覆盆子的根部和果实多酚通过降低NO 的分泌、细胞因子（IL-1、IL-6、IL-10）和前列腺素，证明多酚具有抗炎活性[25]。本研究从实验诱导期开始，除空白组外，其余各组小鼠体重开始下降，灌胃给予肠炎小鼠40 mg/kg、60 mg/kg、100 mg/kg 的多酚后，比较第10 d 时发现，多酚各剂量组动物体重呈上升趋势，多酚干预可以显著抑制DSS 引起的肠炎小鼠体重下降。每3 d 使用EP 管搜集一次粪便，观察发现，空白对照组小鼠实验过程重粪便状态始终正常，干燥且成型不粘着；除空白对照组外，小鼠粪便从实验诱导期开始，变化较为明显，颜色开始变深，松散不成型，出现稀便，进入诱导期第6～7 d，模型组部分小鼠开始出现严重的便血现象。直至多酚干预后第10 d 开始得到缓解，第11 d 后，粪便颜色开始变浅，稀便、便血现象减少。多酚高剂量组动物粪便趋于正常状态。解剖小鼠后，通过测量结肠长度，观察结肠状态，如图2 所示，与DSS 组比较，多酚高剂量组的结肠长度最长，中剂量组次之，低剂量组最短；解剖时发现HC 多酚高剂量组结肠肿胀程度较少，低剂量组略有粘连，说明高剂量组对于DSS 诱导的UC 结肠外观的改善作用优于低剂量组。图1 和图2 表明多酚药物干预UC 小鼠，可以显著降低DAI 指数包括DSS 诱导引起的动物体重下降、便血、结肠缩短现象。

图1 没食子酸标准曲线Fig.1 Standard curve of galic acid

病理学切片观察显示，模型组小鼠肠道杯状细胞被破坏以及大量炎症细胞浸润，HC 多酚改善了结肠组织病变，其中高剂量组明显抑制了结肠组织肿胀和溃疡严重程度，图3 切片显示，UC 小鼠结肠组织杯状细胞增加，肠粘膜完整，高剂量组疗效最佳，其次为中剂量组，呈剂量依赖性。说明HC 多酚可通过修复肠黏膜，减少炎症细胞浸润，从而改善溃疡性结肠炎。

研究表明，TNF-α，IL-6 和IL-1β等炎症因子的异常升高是肠道黏膜的炎性损伤和UC 发生的原因之一[26]。本实验中DSS 组小鼠血清中炎症因子IL-lβ、TNF-a及AST、ALT 表达水平均高于空白组小鼠。Gabele 等[27]研究发现，DSS 诱导小鼠肠道炎症可以促进肠道内毒素移位至肝脏、导致肝脏损伤，与本实验研究结果相似。小鼠在经过DSS 刺激后，激发机体内天然免疫途径，通过受损的肠道黏膜移位至肝脏，通过NF-kappaB炎症信号通路产生大量的肝脏和肠道炎症因子。如表3 所示，经多酚各剂量组药物干预后，UC 小鼠肠道炎症因子显著下降（p＜0.05），说明在降低小鼠血清TNF-α，IL-6 等炎症因子方面具有一定疗效；ALT、AST 是存在与肝脏内的转氨酶，该指标异常升高可显示肝脏炎症或病变，表4 显示，多酚各剂量组数值较模型组下降，肝脏炎症较少；多酚高剂量组肾脏指标Cr 和BUN 数值显著降低（p＜0.05），而低剂量组疗效不明显。HC 多酚可以改善DSS 引起的肝肾炎症指标和肝肾指数的增加。

4 结论

综上所述，鱼腥草多酚提取物可以降低DAI 系数、肝肾炎症指数，抑制肠道炎症因子的升高，改善DSS 诱导的溃疡性结肠炎，且对肝肾没有毒性。因此，HC 多酚防治DSS 诱导的UC 的作用机制可能通过作用于NF-κB 通路，减弱炎症因子表达量的上调，促进UC 小鼠肠粘膜修复，从而抑制肠道炎症反应。其具体的作用机制有待于进一步的研究与证实。因此，鱼腥草多酚具有潜在的药用价值，可作为治疗溃疡性结肠炎的中草药进行开发利用。