支原体肺炎患儿血清miR-222、miR-155与病情严重程度及潮气呼吸肺功能的相关研究

杨利俊，张 谦

内蒙古医科大学附属医院儿科，内蒙古呼和浩特 010050

支原体肺炎为儿童常见社区获得性肺炎，占全部儿童肺炎的20%左右[1]。支原体肺炎具有发病隐匿、易复发、病情迁延不愈等特点。轻症患儿多仅有发热和咳嗽症状，无呼吸困难表现，而重症患儿可合并胸腔积液，甚至包括呼吸系统在内的多系统功能障碍等，严重影响患儿生活质量，甚至危及生命[2]。有研究表明，异常免疫反应及其介导的炎性反应可能是支原体肺炎的重要发病机制[3]。微小核糖核酸(miRNA)为一类长度约为22 nt的非编码单链RNA分子。近年研究发现，miRNA具有调节免疫反应和炎性反应的作用[4]。CHU等[5]研究发现，支原体肺炎患儿外周血miR-222-3p水平明显升高，尤其在合并胸腔积液患儿中高表达。有研究指出，miR-155参与调控免疫应答、炎性反应等多种细胞功能，且可通过靶向调控多种细胞因子表达，参与肺炎等肺部疾病发生和发展[6]。故miR-222和miR-155在支原体肺炎中的表达及其与疾病发生、发展的关系值得进一步探讨。因此，本研究通过检测支原体肺炎患儿血清miR-222和miR-155水平，探讨二者与病情严重程度、潮气呼吸肺功能的关系，旨在为支原体肺炎的临床诊断及治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2019年1月至2020年12月本院收治的188例支原体肺炎患儿为研究对象。纳入标准：(1)3～16岁；(2)符合支原体肺炎诊断标准[7]；(3)可配合进行潮气呼吸肺功能检测；(4)患儿及其法定监护人对本研究知情同意并签署知情同意书。排除标准：(1)合并细菌、病毒、肺炎衣原体等感染；(2)既往有呼吸系统疾病史；(3)合并慢性基础疾病，严重肝、肾等脏器功能不全，自身免疫性疾病，哮喘；(4)近1个月内接受过抗感染治疗。根据病情严重程度将188例患儿分为轻症组和重症组[7]，轻症组96例，男44例，女52例；年龄3～15岁，平均(6.34±2.12)岁；重症组92例，男41例，女51例；年龄4～14岁，平均(6.28±2.23)岁。选择同期本院体检健康儿童作为健康对照组，无呼吸系统感染、自身免疫性疾病及相关病史，且近1个月内未接受过抗感染治疗。健康对照组共84例儿童，男37例，女47例；年龄3～15岁，平均(6.37±2.25)岁。3组儿童性别、年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究获得本院医学伦理委员会批准后进行。

1.2血清miR-222和miR-155水平检测 (1)采集所有研究对象空腹外周静脉血2 mL，分离血清，加入TRIzol试剂(北京百奥莱博科技有限公司，货号GL1311)提取总RNA，测定RNA纯度和水平。(2)反转录合成cDNA，试剂盒购自德国Qiagen公司(货号205111)。(3)由上海生工生物工程股份有限公司设计引物序列。miR-222上游引物：5′-GCGAGCTACATATGTGGA-3′，下游引物：5′-CATGGCGTGTAGTGGAGT-3′。miR-155上游引物：5′-GGGACGTGGTTTAAGTGC-3′，下游引物：5′-CCGTTTGCAACTGTGTAT-3′。U6为内参，上游引物：5′-ATTGGACAGTATGACAAA-3′。(4)引物合成后，PCR仪(美国赛默飞世尔公司，型号ProFlex)进行反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)。反应体系：SYBRTMGreen PCR Master Mix(美国赛默飞世尔公司，货号4309155)10.0 μL，cDNA 1.0 μL，上游和下游引物各0.5 μL，ddH2O 8.0 μL。反应条件：95 ℃预变性5 min，1次，94 ℃变性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共45个循环，72 ℃延伸7 min，1次。(5)绘制标准曲线，计算循环阈值(Ct)，Ct=—1/lg(1+Ex)×lgX0+lgN/lg(1+Ex)，其中Ex为扩增效率，X0为初始模板量，N为荧光扩增信号到达阈值强度时扩增产物量，采用2—ΔΔCt法进行定量分析。

1.3潮气呼吸肺功能检测 检查当日清理鼻腔分泌物，保持上呼吸道通畅；操作尽量避免进餐期间，可于进食后30 min至2 h进行；测量儿童体质量，精确至0.5 kg；检查前，幼儿及配合度较差儿童根据体质量给予10%水合氯醛，剂量为0.5 mL/kg，口服或保留灌肠，配合度较好儿童嘱静坐；选择适宜大小面罩，紧扣口鼻，保证无漏气；调节肺功能仪(德国耶格医疗器械有限公司，型号MasterScreen PFT System)参数，待呼吸平稳后，连续记录5次，每次记录100个潮气呼吸流量-容积环，取平均值作为最终结果。

1.4观察指标 分析各组血清miR-222、miR-155水平及潮气呼吸肺功能指标，其中潮气呼吸肺功能指标包括呼吸频率(RR)、潮气量(VT)、呼气时间(Te)、达峰时间(TPTEF)、达峰容积(VPTEF)，达峰时间/呼气时间(TPTEF/Te，%)=TPTEF/Te×100%，达峰容积/潮气量(VPTEF/VT，%)=VPTEF/VT×100%。

2 结 果

2.13组儿童血清miR-222和miR-155水平比较 与健康对照组比较，轻症组、重症组儿童血清miR-222和miR-155水平明显升高，且重症组高于轻症组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 3组儿童血清miR-222和miR-155水平比较

2.23组儿童潮气呼吸肺功能比较 与健康对照组比较，轻症组、重症组儿童VT、TPTEF/Te和VPTEF/VT明显降低，RR明显升高，且重症组较轻症组变化更明显，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 3组儿童潮气呼吸肺功能比较

2.3血清miR-222、miR-155水平与病情严重程度、潮气呼吸肺功能的相关分析 血清miR-222、miR-155水平分别与VT、TPTEF/Te、VPTEF/VT呈负相关，与病情严重程度、RR呈正相关(P<0.05)。见表3。

表3 血清miR-222、miR-155与病情严重程度、潮气呼吸肺功能的相关分析

2.4支原体肺炎患儿病情严重程度的多元Logistic回归分析 以miR-222和miR-155为自变量，病情严重程度为因变量，进行多元Logistic回归分析结果显示，miR-222、miR-155水平升高为影响支原体肺炎病情严重程度的独立危险因素(P<0.05)。见表4。

表4 支原体肺炎患儿病情严重程度的多元Logistic回归分析

2.5支原体肺炎患儿潮气呼吸肺功能的回归分析 以miR-222和miR-155为自变量，潮气呼吸肺功能为因变量，进行多元Logistic回归分析结果显示，miR-222、miR-155水平升高为影响支原体肺炎潮气呼吸肺功能独立危险因素(P<0.05)。见表5。

表5 支原体肺炎患儿潮气呼吸肺功能的多元Logistic回归分析

3 讨 论

近年来，我国儿童支原体肺炎发病率日趋升高，且有小范围流行趋势[8]。肺部感染支原体后，不仅会引起呼吸道病变，还可累及其他器官或系统[9]。大量研究表明，免疫[10]及炎性反应[11]与儿童支原体肺炎密切相关。miRNA在支原体肺炎发病机制中发挥重要作用[12]。miR-155为调控炎症因子表达的重要miRNA。徐长娣等[13]通过miRNA芯片技术筛选支原体肺炎患儿与健康儿童血液淋巴细胞差异表达的miRNA发现，支原体肺炎患儿血液淋巴细胞中共筛选出238个具有明显差异的miRNA，与健康儿童比较，支原体肺炎患儿血液淋巴细胞中miR-155水平明显上调。丁莹等[14]利用miRNA芯片技术筛选支原体肺炎患儿与健康儿童血浆差异表达的miRNA发现，支原体肺炎患儿血浆标本中共筛选出26个具有明显差异的miRNA，与健康儿童比较，支原体肺炎患儿血浆标本中miR-222-3p表达明显上调。故笔者猜想与miR-222-3p具有同源性的miR-222也可能在支原体肺炎中异常表达。

本研究采用RT-PCR法检测血清miR-222和miR-155水平发现，与健康对照组比较，轻症组与重症组血清miR-222和miR-155水平明显升高，符合以往研究结果[5，15]，提示miR-222和miR-155可能参与支原体肺炎发病机制，且重症组高于轻症组，提示miR-222和miR-155也参与了支原体肺炎进展，有可能成为判断病情严重程度的指标。支原体感染可引起气道炎性反应及气道高反应性，导致肺功能损伤[16]。因此，肺功能检查成为判断病情严重程度及预测预后的重要手段，但儿童尤其是幼儿配合度相对较差，故相比于常规肺功能检查，潮气呼吸肺功能检测可能更具有实用性，无需患儿特殊配合，且具有重复性好、操作简便、参数稳定等优势。本研究结果显示，与健康对照组比较，轻症组与重症组VT、TPTEF/Te和VPTEF/VT明显降低，RR明显升高，重症组变化更明显，提示支原体肺炎患儿存在小气道功能和阻塞性通气功能障碍，且重症患儿可出现限制性通气功能障碍。相关分析得出，血清miR-222、miR-155分别与VT、TPTEF/Te、VPTEF/VT呈负相关，与病情严重程度、RR呈正相关，表明miR-222、miR-155与支原体肺炎病情严重程度、潮气呼吸肺功能具有一定关联。通过多元Logistic回归分析发现，miR-222和miR-155水平升高为影响支原体肺炎病情严重程度和潮气呼吸肺功能的独立危险因素，进一步证实miR-222和miR-155在支原体肺炎病情评估和预后判断中的重要价值。

综上所述，支原体肺炎患儿血清miR-222和miR-155表达上调，且是影响病情严重程度和潮气呼吸肺功能的重要因素，可作为病情评估和预后判断的指标。