球孢白僵菌对黄瓜代谢产物及西花蓟马取食行为的影响

张 妍，王子豪，李凯月，王俊平

(青岛农业大学植物医学学院，山东青岛 266000)

球孢白僵菌是一种广泛用于农林害虫生物防治的昆虫病原真菌，同时球孢白僵菌对植物的生长具有促进作用，并且能提高植物的抗病性(隋丽等, 2018)。在烟草上接种球孢白僵菌后，烟蚜的死亡率在第4～5天达到死亡高峰，对烟草植株上的烟蚜具有较强的致病侵染力(徐继伟等, 2019)。在研究中还发现球孢白僵菌处理植物可提高植物的防御能力，降低害虫对其危害程度，球孢白僵菌处理玉米和高粱后，发现两种植物中棉铃虫Helicoverpaarmigera蛀食减少，并且未在植株上观察到白僵菌引起的伤害(Cherryetal., 1999; Reddyetal., 2009)；随后发现用球孢白僵菌接种的番茄和棉花饲喂棉铃虫，棉铃虫死亡率高于对照组(Powelletal., 2009; Lopez and Gregory, 2015)，并且球孢白僵菌可促进植物的生长(Lopez and Gregory, 2015)。球孢白僵菌处理罂粟和香蕉后可减少钻蛀性害虫罂粟抗茎瘿蜂和香蕉茎象甲Cosmopolitessordidus的危害(Akelloetal., 2008; Quesadaetal., 2009)。除球孢白僵菌处理植物就有抗虫能力以外，其他真菌也有相似的功能，顶孢霉Acremoniumhansfordii接种蚕豆后饲喂棉铃虫其死亡率高于对照组，发现了还可延长棉铃虫的生长周期(Jaberetal., 2010)。

本课题组在研究中发现球孢白僵菌灌根处理黄瓜后，西花蓟马对叶片危害面积显著低于对照组，但是未见针对这一问题的相关研究。为了探讨该现象出现的原因，采用球孢白僵菌对黄瓜进行灌根，以确定处理过的黄瓜植株体内几种防御酶、次生代谢物、可溶性蛋白的含量变化；并利用EPG技术分析西花蓟马在黄瓜上的取食行为，以期为进一步利用球孢白僵菌防控西花蓟马提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

西花蓟马种群在室内以芸豆为食物连续饲养120代以上，饲养条件为温度27℃±1℃，相对湿度75%±5%，光周期L ∶D=16 ∶8；从僵蚕上分离纯化获得球孢白僵菌菌株Bb33A (KU517852)，保存于青岛农业大学昆虫生理生态研究室；黄瓜种子(津研四号)，基质(草炭土 ∶蛭石 ∶珍珠岩=1 ∶1 ∶1)，购于青岛德地得农化服务有限公司；直流刺吸电位仪(Direct current electrical penetration graph, DC-EPG)。

1.2 球孢白僵菌的培养和分生孢子液的制备

1.2.1球孢白僵菌的培养

参考张志建等(2017)方法将球孢白僵菌在SDAY培养基上于25℃，光照L ∶D=10 ∶14的条件下培养7 d，无菌棒刮取分生孢子粉于1.5 mL Eppendorf管中(张志建等, 2017)。

1.2.2球孢白僵菌分生孢子液的制备

将球孢白僵菌溶于0.05% Tween-80中，并以0.05% Tween-80、无菌水作为对照。在涡旋震荡器上震荡10 min，使白僵菌孢子充分分散。梯度稀释至适宜浓度，用血球计数板在显微镜下统计溶液中的孢子数量，每株菌株观察5个视野。重复 3次，分生孢子终浓度为1×108和1×109spores/mL。

1.3 球孢白僵菌灌根处理黄瓜

大小均匀饱满的黄瓜种子浸于水中6 h，将其栽种到花盆中。栽培7 d后将50 mL无菌水、0.05% Tween-80溶液和球孢白僵菌分生孢子溶液(浓度分别为1×108spores/mL和1×109spores/mL)，分别倒入生长一致的黄瓜幼苗中，于25℃，光照L ∶D=16 h ∶8 h下培养7 d。

1.4 西花蓟马对黄瓜为害

将15头西花蓟马初孵雌成虫接于栽培7 d后的黄瓜苗上，24 h后移除西花蓟马，处理后第4，5，6，7天记录西花蓟马成虫和幼虫数量，17 d后进行为害叶片拍照，每处理重复5次，利用使用Image J软件对叶片危害面积进行分析。

1.5 球孢白僵菌处理的黄瓜叶片物质测定

1.5.1丙二醛MDA、可溶性蛋白含量、CAT、POD和SOD活性测定

丙二醛MDA、可溶性蛋白含量、CAT、POD和SOD活性测定分别用苏州科铭生物技术有限公司的MDA-1-Y丙二醛(MDA)试剂盒、KMSP-1-W考马斯亮蓝法蛋白含量测试盒、CAT-1-Y过氧化氢酶(CAT)试剂盒(紫外吸收法)、POD-1-Y过氧化物酶(POD)试剂盒和SOD-1-Y超氧化物歧化酶(SOD)测试盒(NBT法)进行测定。取处理后第7天和第14天的黄瓜叶片，严格按照试剂盒中方法提取待测物质，然后进行相关指标测定，每处理均重复3次。

1.5.2次生代谢物质类黄酮和单宁含量测定

类黄酮和单宁的含量分别用LHT-1-G植物类黄酮测试盒和DN-1-Y单宁含量试剂盒(苏州科铭生物技术有限公司生产)进行测定。取处理后第7、9、11、13和15天取黄瓜叶片，按照相关说明书要求提取待测物质后进行含量测定，每处理均重复3次。

1.6 刺吸电位波形EPG分析

对经球孢白僵菌(1×108spores/mL)处理后7 d的黄瓜幼苗进行EPG分析，采用具有八通道EPG刺吸电位仪(DC-EPG型)进行取食行为观察(胡想顺等, 2006; 张玉秀等, 2014)。首先将西花蓟马成虫置于冰袋上，然后用银胶将金丝线粘合在其背板上；待银胶干后，将蓟马置于平面上自由活动1 h，使其适应背部粘合金线的状态。然后，将长约10 cm的铜质棒状植物电极插人植株盆栽土壤中，再将粘好蓟马的铜钉插人对应的插槽内，蓟马置于供试植株顶端第2片真叶的叶面上，使其可以相对自由地活动。整个试验置于80 cm×70 cm×80 cm的金属笼中，以避免噪音干扰，试验条件为温度(27±1)℃，相对湿度75%±5%。采用软件Stylet对西花蓟马取食行为进行记录。

1.7 数据处理与分析

采用Microsoft Excel 2016对试验数据进行统计，并以平均值±标准偏差表示。通过SPSS 20.0软件进行方差和Duncan氏多重比较差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 西花蓟马对根施球孢白僵菌黄瓜上为害的情况

在处理后不同时间点检查各处理黄瓜叶片上西花蓟马的数量，结果表明，各时间点两个浓度球孢白僵菌处理与对照组黄瓜上的西花蓟马数量差异不显著(图1)，但是该虫在球孢白僵菌处理的黄瓜叶上的危害面积明显低于对照组，但两个分生孢子浓度处理后的黄瓜叶片上西花蓟马的危害面积无明显差异(图2和图3)。

图1 西花蓟马在黄瓜叶片上的虫口数量Fig.1 Insect population of Frankliniella occidentalis on cucumber leaves注：柱状图中小写字母表示组间差异显著性(P<0.05)，相同小写字母表示组间差异不显著，不同小写字母表示组间差异显著，各值为均值。下图同。Note: In the histogram, different small letters indicated significant differences between groups (P<0.05), same small letters indicated no significant differences between groups and each value was the mean value.The same below.

2.2 黄瓜叶片MDA和可溶性蛋白的变化

球孢白僵菌分生孢子处理7 d和14 d后，黄瓜叶片的MDA含量显著低于对照组，并且差异显著，而可溶性蛋白含量显著高于对照组(图4)；球孢白僵菌分生孢子处理的黄瓜叶片内MDA和可溶性蛋白的含量随分生孢子浓度增加无显著变化(图5)。

2.3 黄瓜叶片SOD、POD和CAT的变化

经球孢白僵菌处理黄瓜7 d和14 d，叶片中SOD、POD和CAT的活性高于对照组(图6)；但是不同浓度的球孢白僵菌分生孢子处理黄瓜后，在相同处理时间上SOD和POD活性无明显差异，而CAT的活性随着球孢白僵菌分生孢子浓度的增加而提高。1×109spores/mL球孢白僵菌分生孢子处理黄瓜14 d后SOD和POD最高值为212.5661 U/g和4 400 U/g，分别是对照组水的1.33倍和1.09倍。1×108spores/mL和1×109spores/mL球孢白僵菌分生孢子处理黄瓜14 d后CAT活性达到最高值为0.4886 U/g和0.5275 U/g，分别是对照组水的1.25倍和1.34倍的。

图2 西花蓟马对黄瓜叶片的危害Fig.2 Damage of cucumber leaf with Frankliniella occidentalis注：a，对照；b，吐温80；c，1×108 孢子/mL；d，1×109 孢子/mL。Note: a, control; b,tween-80; c, 1×108 spores/mL; d, 1×109 spores/mL.

图3 西花蓟马对黄瓜叶片危害面积Fig.3 Damage area of Frankliniella occidentalis to cucumber leaves

图4 球孢白僵菌处理后黄瓜中MDA含量变化Fig.4 Changes of MDA content in cucumber treated with Beauveria bassiana

图5 球孢白僵菌处理黄瓜后后对可溶性蛋白的变化Fig.5 Changes of soluble protein in cucumber treated with Beauveria bassiana

2.4 黄瓜叶片中类黄酮和单宁含量

经球孢白僵菌处理黄瓜7 d和15 d后，叶片类黄酮的含量明显高于对照组，而单宁含量与对照组无明显差异(图7和图8)。分生孢子浓度从1×108spores/mL提高到1×109spores/mL时，黄瓜叶片中类黄酮的含量也随之增加，在7 d含量分别为57.42 mg/g和43.56 mg/g，13 d达到最大值(74.76 mg/g和70.88 mg/g)，之后含量下降(图7)。

2.5 西花蓟马EPG取食行为分析

经球孢白僵菌处理黄瓜7 d后，西花蓟马第一刺探的持续时间、长取食次数、R波总持续时间以及平均取食时间分别为0.23 s、10.5 s、7 666.51 s和86.72 s，明显低于两个对照组，但是从EPG开始到第一次刺探的时间为228.67 s，明显高于两个对照组。

图6.1 球孢白僵菌处理黄瓜后SOD的变化Fig.6.1 Changes of SOD in cucumber after Beauveria bassiana treatment

图6.2 球孢白僵菌处理黄瓜后POD的变化Fig.6.2 Changes of POD in cucumber after Beauveria bassiana treatment

图6.3 球孢白僵菌处理黄瓜后CAT的变化Fig.6.3 Changes of CAT in cucumber after Beauveria bassiana treatment

图7 黄瓜经不同浓度球孢白僵菌处理后类黄酮含量变化Fig.7 Changes of flavonoids content in cucumber treated with Beauveria bassiana

图8黄瓜经不同浓度球孢白僵菌处理后单宁含量变化Fig.8 Change of tannin content in cucumber treated with Beauveria bassiana

表1 球孢白僵菌处理黄瓜后西花蓟马在叶片上取食行为(Mean±SE)

3 结论与讨论

西花蓟马取食经球孢白僵菌处理的黄瓜叶片，西花蓟马的数量和繁殖能力并无明显差异，但西花蓟马对黄瓜叶片的危害面积是降低的。本研究发现经球孢白僵菌处理的黄瓜叶片中可溶性蛋白、SOD、CAT、POD及类黄酮的含量上升，而MDA的含量呈现下降趋势，单宁含量则无明显变化。

植物体内氧化酶浓度的提升，次生代谢物的产生，或通过诱导植物的间接系统防御反应从而对昆虫的取食产生抗性(秦秋菊和高希武, 2005)。棉花接种球孢白僵菌和内生淡紫拟青霉菌后对其生长有促进作用，同时对棉铃虫的存活和发育有毒害作用(Lopezetal., 2015)。番茄幼苗接种球孢白僵菌后，番茄幼苗根部的PAL、POD、PPO、SOD活性均高于对照，可溶性蛋白的含量也显著增加，对番茄根结线虫病害具有较好的防治效果(陈增齐等, 2009)。本研究也发现黄瓜经球孢白僵菌菌株处理后，叶片SOD、POD、CAT的活性和可溶性蛋白含量高于对照组。同时研究中还发现施用球孢白僵菌的黄瓜叶片中的MDA含量呈现下降趋势。MDA用来衡量膜脂过氧化程度的强弱，MDA含量多，则细胞膜流动性下降，膜功能受到损伤(Ariasetal., 2005)，因此MDA含量降低的同时，细胞膜的耐氧化程度提高。植物体内类黄酮的含量与植物的抗虫性呈正相关关系，其含量越高，美国白蛾对植株的取食量越低(李路莎等, 2018)。本研究也发现黄瓜经球孢白僵菌菌株处理后，叶片类黄酮活性高于对照组。综合分析本试验和已有研究结果，推断球孢白僵菌处理黄瓜体内相关物质的变化是西花蓟马对其叶片的危害面积低于对照组的原因。

采用EPG技术对西花蓟马在不同处理的黄瓜上的刺探行为进行分析，西花蓟马在取食期间产生了6种不同的波形，分别是非刺探波(np波)、上颚口针刺入波(P波)、上颚口针重复刺吸波(S波)、下颚口针刺入(Q波)、细胞内取食波(R波)、不规则波形(X波)(Kindtetal., 2003)。并且西花蓟马在取食中的细胞内取食波(R波)与蚜虫取食中的韧皮部取食波(E2波)具有相似的生物学功能。麦长管蚜Sitobionavenae在吡虫啉、噻虫嗪、呋虫胺和吡蚜酮等药剂处理下的E2波的总持续时间明显低于对照组(彭建红, 2018)；禾缢管蚜Rhopalosiphumpadi和苜蓿斑蚜Theriaphistrifolii在抗性品种上E2波的总持续时间明显低于抗性小的品种(Beantetal., 2020; 周雪飞等, 2020)；说明E2波的总持续时间与寄主对昆虫取食抵抗能力相关。西花蓟马需对寄主进行表面物质识别，进而完成取食的下一步的“刺探”。本试验研究发现西花蓟马在接种球孢白僵菌的黄瓜上从EPG开始到第一次刺探时间为228.67 s，而在清水处理黄瓜上的时间为4.9 s，表明西花蓟马对接种球孢白僵菌的黄瓜选择性倾向低于对照组。而西花蓟马在接种球孢白僵菌的黄瓜上第一次刺探的持续时间、R波的总持续时间、长取食次数以及平均取食时间均低于对照组，表明了西花蓟马对接种球孢白僵菌的黄瓜取食量低，反映出西花蓟马在对寄主植物分析完成后会对取食策略进行了调整。

综上所述，黄瓜植株接种球孢白僵菌后，黄瓜体内相关物质的变化，造成西花蓟马取食行为的改变，并且其对黄瓜叶片危害下降，使其具有一定的抗虫性，为提高植物的抗虫性提供了理论依据。