云南切梢小蠹对初侵害云南松挥发物的电生理和行为反应

严 广，张梦蝶，钱路兵，泽桑梓，杨 斌，3，李宗波，3*

(1. 西南林业大学生物多样性保护学院,云南省森林灾害预警与控制重点实验室，昆明 650224；2. 云南省林业和草原有害生物防治检疫局，昆明 650224；3. 西南山地森林资源保育与利用教育部重点实验室，昆明 650224)

云南切梢小蠹Tomicusyunnanensis(Kirkendall and Faccoli)隶属鞘翅目Coleoptera象虫科Curculionidae小蠹亚科Scolytinae林小蠹族Hylurgini，是云南松林最具危害性的一种钻蛀害虫(Kirkendalletal., 2008; 叶辉, 2011)。先前很长一段时间，该蠹虫一直被认为与我国东北和亚欧林区的纵坑切梢小蠹T.piniperda为同一物种，但分子分析显示该物种与纵坑切梢小蠹存在较远的遗传距离(Duanetal., 2004)，随后详细的形态比对证实两者鞘翅表面刻点和颗粒有着明显的不同，应被视作切梢小蠹属的一个新物种(Kirkendalletal., 2008)。因此，该虫被正式命名为云南切梢小蠹，用于取代纵坑切梢小蠹、云南松纵坑切梢小蠹，或者云南纵坑切梢小蠹等别称。云南切梢小蠹具有独特的危害习性：新羽化的云南切梢小蠹蛀食新鲜嫩梢，一般仅选择健康松树补充营养，致使树势衰弱；待性成熟后，云南切梢小蠹则选择衰弱的松树作为寄主，并在树干韧皮部取食、产卵和繁殖，最终致使树木死亡(叶辉, 2011; Lieutieretal., 2015)。可见，云南切梢小蠹存在一个明显的蛀梢期、蛀干期和转移期，但转移期是相当短暂的，且发生时间多集中在早晨，而其余生活史，诸如交配、产卵、幼虫发育、化蛹和羽化等过程均在树干内完成。正是由于这种隐蔽的生活方式和空间迁移，使得云南切梢小蠹防治难度大，在云南每年均大面积发生，危害面积已达每年13.33万ha/年，并向四川、贵州等地持续扩散(图1)，严重影响我国西南地区的生态环境安全和生物多样性保护(季梅等, 2007; 叶辉, 2011)。采用何种方式使之有虫不成灾？当然，基于生态调控的害虫可持续控制是实现该目的不二选择，即捋顺调节与控制的关系，整合包括林业技术措施、生物防治、理化诱控技术以及合理的化学防治等多元措施，以将害虫长时间控制在经济阈值之下(戈峰, 2020)。在这个过程中，理化诱控是不可少的，特别是与害虫寄主选择和配偶识别相关的信息化学物质，如寄主植物气味，能够单独或与信息素结合产生增盈效应，适宜于种群监测、大规模诱杀、迷踪等措施来降低害虫的种群数量。并且，这些化学信号具有良好的稳定性(Constancy)和持久性(Consistency)，符合绿色无公害、环境友好的林木害虫治理的发展趋势，也是生态调控过程中最为倚重的一种行为调控技术(Raffaetal., 2016; 戈峰, 2020)。另一方面，尽管云南切梢小蠹存在梢转梢、梢转干和干转梢这样一个干外生活时期，但持续时间短，加之云南切梢小蠹并不像大小蠹Dendroctonusspp.、齿小蠹Ipsspp.等能够进行长距离扩散(Chenetal., 2011)，其扩散主要集中在梢与梢和树与树之间的局域空间内，显示出低攻击密度阈值(Critical threshold of attack density)的云南切梢小蠹对寄主选择应具有更好的辨识能力(Lieutieretal., 2015; Raffaetal., 2016; Mülleretal., 2020)，但一些研究发现切梢小蠹在攻击寄主过程中并不会分泌聚集信息素(Lieutieretal., 2015; Raffaetal., 2016)。但最近，Wuetal.(2019)发现云南切梢小蠹后肠中存在聚集信息素—(-)-顺马鞭草烯醇，且在蛀梢期和蛀干期均有，只是含量有所不同，这说明云南切梢小蠹能够利用信息素对种群数量进行调控，而寄主气味在此过程中的作用不可忽视(Raffaetal., 2016; Mülleretal., 2020; 戈峰, 2020)。虽然已有一些学者研究了寄主气味和聚集信息素的引诱功能(李丽莎等, 1993; 周楠等, 1997; 殷彩霞等, 2002; 路荣春等, 2008; 闫争亮等, 2011)，但林间引诱效果不佳，几乎无法诱捕到云南切梢小蠹，意味着诱剂方面存在明显的缺陷。特别是考虑到云南切梢小蠹蛀梢时和蛀干期的营养需求以及信号的空域异质性(闫争亮等, 2011; Lieutieretal., 2015; Mülleretal., 2020)，非常有必要重新检视一下寄主气味的空间分布及其功能差异。因此，本文应用顶空动态法和溶剂提取法，分别收集了初侵染云南松针叶和松脂的挥发性化学物质，并结合气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)、气相色谱-昆虫触角电位测量系统(GC-EAD)和生测法，鉴定和筛选了对云南切梢小蠹具有活性功能的气味成分，以期为开发植物源引诱剂或与聚集信息素结合进行种群的理化调控和大规模诱杀提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试虫来源

试虫采集于云南省曲靖市沾益区九龙山林场(N 25°39′51.2″，E 103°47′45.1″，图1)。选择正在云南松松梢内取食的切梢小蠹，然后将其带回实验室，再根据鞘翅斜面第二沟间部颗瘤有无、刻点排列、颗瘤毛长短、腹部背板形态以及是否可见第8节等特征鉴定云南切梢小蠹雌、雄成虫(Kirkendalletal., 2008)。将鉴定好的成虫分别置入4℃冰箱内保存待用，保存时间不超过3 d。

图1 云南切梢小蠹的地理分布及其试虫来源地(阴影区)Fig.1 Geographic distribution and sampling site (shadow zone) of Tomicus yunnanensis in Yunnan, Southwest China

1.2 云南松挥发物的收集与分析

参照云南松受害木的分级标准(刘宏屏等, 2014)，首先选择松针呈绿色至浅绿色，枝梢已开始变黄，伴随着少量的虫孔和凝脂的云南松作为初侵木，接着选择5株初侵木，按顶空动态法(Faccolietal., 2008)和浸提法(Munroetal., 2020)分别收集针叶和松脂的挥发性化学物质。

顶空动态法：选择未被蛀害的云南松枝条，然后将其用无味透明的塑料袋(PTEK, Wursthüllen, German)包裹，进气端空气用活性炭(ORBOTM-32, Supelco, USA)过滤，气体流速400 mL/min，出气端经120 mg Porapak Q(50～80目，Supelco，USA)吸附，流速为300 mL/min，持续收集12 h。完毕后，用色谱纯级的正己烷(Tedia, USA)洗脱，收集300 μL洗脱液于2 mL棕色试剂瓶(12×32 mm, PTFE, Agilent)内。最后经N2浓缩定容至100 μL，将其保存在-20℃冰箱内待用。

浸提法：用定量的采血管(105 mm, 100 μL,宇轩, 中国)收集新鲜松脂50 μL，接着滴入500 μL正己烷溶液中，经12 h静置(4℃)后，将滤液转移至另一干净的2 mL试剂瓶中，-20℃冷藏备用。

化合物分析：采用Agilent HP7820A/5977B GC-MS进行。进样量为1 μL，分流比为30 ∶1，质谱柱为HP-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。高纯氦气作为载气(1.0 mL/min)，压力10 psi。升温程序：起始温度40℃，保持2 min；以5℃/min的升温速率升至280℃，保持5 min。质谱离子源温度230℃，电离能70 eV，扫描范围50～600 m/z。化学物质鉴定采用NIST 98 MS谱库检索法、保留指数法和参考相关文献法(Adams, 2007)加以确定。

1.3 触角电位(GC-EAD)

将恢复活性的云南切梢小蠹的头部切下，用拉制的毛细管尖端刺入头部血腔(参比电极)，固定在微动操作台上，调整距离，以便另一毛细管尖端套入触角锤头部(记录电极)。参比电极和记录电极玻璃管内充满林格氏液，内插Ag/Agcl细丝用于导电。湿润空气流持续吹向固定好的触角，流速400 mL/min。将2.0 μL浓缩液从气相色谱进样口注入，然后经一个四壁不锈钢分流装置将浓缩液按照1 ∶1方式分别注入GC和吹向触角，吹向触角的挥发物经加热罩加热至260℃，GC升温程序和色谱柱型号均与GC-MS保持一致，但GC不分流。刺激信号通过接受器放大、处理、记录和储存，通过软件Autospike(Version 3.6, Syntech)显示在计算机屏幕上。雌、雄成虫各进行5～8次重复测试。

1.4 生测法

采用Y型嗅觉仪进行行为选择性测试。先将样品和空白对照(二氯甲烷)滴在玻璃棉上，室温放置30 min后，置于一个球形容器内，并与Y型管的两臂相连，然后开始抽气，气流经活性炭过滤，再经加湿吹向释放管内的云南切梢小蠹，气流速度300 mL/min，设置反应时间为5 min，超过反应时间的小蠹虫将其移出，记作不反应。每个化合物重复5次，每次测试30头，测试5头后，调换左右臂；10头后，更换新的Y型管，并用乙醇清洗、100℃烘干。测试过的小蠹不再使用。

1.5 数据处理与分析

所有的数据分析均在RStudio(R version 4.05,https://cran.r-project.org/)平台上进行。为了对比云南松松针与松脂间气味的异同，数据首先进行平方根转换和Wisconsin双重标准化，然后用非对称的Bray-curtis距离建立一个数值介于0～1的距离矩阵，并用非度量多维标度(Vegan 2.5-7, https://cran.r-project.org/web/packages/vegan/index.html)计算矩阵间的最佳距离，最后用多重响应排列程序(multi-response permutation procedure, MRPP)分析配对样本间的相似性，置换检验的次数设定为10 000。对于GC-EAD数据，先将其导入到Origin中，再对EAG和FID信号进行基线校准和低通滤波过滤，绘制出云南切梢小蠹的触角电位图谱。对于行为选择性数据，采用Welch双样本t检验，并用GraphPad Prism(Version 8.0.2)进行绘图。

2 结果与分析

2.1 初侵云南松针叶和松脂挥发物的组成

初侵云南松针叶和松脂中共有18种化合物，均为萜烯类化学物质(表1)。其中，针叶挥发物由单萜类和倍半萜两类组成，前者占总含量的99.98%，含量超过1%的化合物有α-蒎烯、β-蒎烯、D-柠檬烯、莰烯和β-月桂烯，尤以α-蒎烯含量最高，最低含量也接近于80%；而后者仅有石竹烯一种，且仅被发现一次，含量为0.2%。松脂挥发物包括了单萜类、倍半萜类和双萜类三类化学物质，单萜类和双萜类含量较高，α-蒎烯、3-蒈烯和异松油烯是单萜类的主要成分，含量分别为21.38%、21.42%和2.78%；倍半萜有3种，但含量较低，以石竹烯(0.13%)和顺-β法尼烯(0.22%)为主；双萜类含量最高，但仅有一种双萜类氧化物长叶松酸，含量超过了50%。经非度量多维标度排序，初侵染云南松松针和松脂挥发物的空间分化明显(图2)，多重响应排序显示两者之间差异显著(A=0.788，P=0.009)。

图2 初侵染云南松松针和松脂挥发物的非度量多维标度排序Fig.2 Non-metric multidimensional scale (NMDS) ordination of volatile compositions from the needle and fresh resin of Pinus yunnanensis primarily infected by Tomicus yunnanensis

表1 初侵染云南松松针和松脂挥发物的组成与含量

2.2 云南切梢小蠹的触角电位反应

通过对初侵染云南松松针和松脂挥发物的GC-EAD测定发现：云南切梢小蠹成虫对针叶中的α-蒎烯、β-蒎烯和γ-萜品烯有触角电位反应(图3-A)，而对松脂中的α-蒎烯、β-蒎烯、3-蒈烯和4-烯丙基苯甲醚有电生理反应(图3-B)。进一步，用化合物标准品(0.45 ng/μL)进行GC-EAD验证显示：云南切梢小蠹对4-烯丙基苯甲醚最大的反应强度(-0.122±-0.018 mV)，其次为α-蒎烯(-0.068±-0.004 mV)、γ-萜品烯(-0.05±-0.008 mV)和β-蒎烯(-0.041±-0.006 mV)，最小的则是3-蒈烯(-0.014±-0.001 mV)。

2.3 云南切梢小蠹对活性气味的行为选择性

通过对初侵染云南松挥发物中的5种化合物的行为选择性测试发现：α-蒎烯、3-蒈烯和γ-萜品烯对云南切梢小蠹具有明显的正趋性，即具有引诱功能，而4-烯丙基苯甲醚和β-蒎烯则表出现负趋向性，有驱避作用(图4)。

图3 云南切梢小蠹对初侵染云南松松针(A)和松脂挥发物(B)的触角电位反应Fig.3 GC-EAD recordings of antenna of Tomicus yunnannesis responding to headspace needle odors (A) and freshly tapped resin (B) from primarily infected host Pinus yunnanensis, respectively

图4 云南切梢小蠹对活性气味的选择性反应Fig.4 Choice rate of Tomicus yunnanensis exposed to five biologically-active compounds in a GC-EAD

3 结论与讨论

云南切梢小蠹对初侵染云南松挥发物中的α-蒎烯、β-蒎烯、3-蒈烯、γ-萜品烯和4-烯丙基苯甲醚有触角电位和行为反应，但反应强度和趋向性有所不同。其中，触角电位反应中等的α-蒎烯、γ-萜品烯以及最小的3-蒈烯表现出正趋性，即引诱作用，而触角电位反应最强的4-烯丙基苯甲醚和中等的β-蒎烯则为负趋向性，有驱避功能。考虑到初侵染云南松针叶和树干挥发物组成及其空间分布(图2)，活性成分的差异性可能暗示着云南切梢小蠹的性成熟程度或者卵巢发育进度，影响云南切梢小蠹对寄主挥发物的嗅觉和行为反应。

3.1 云南松挥发物的组成

与其它松属植物类似，云南松能够释放非常丰富的挥发性物质，尤其是单萜类，但化合物种类及其含量上有着显著不同(Hengxiaoetal., 1999; 赵涛等, 2002; 殷彩霞等, 2002; 路荣春等, 2008; 杨燕等, 2009; 闫争亮等, 2011)。例如，丁靖凯等(1987)用水蒸气蒸馏法鉴定了松针的挥发物，但仅鉴定出26种化合物，α-蒎烯(30%～90%)和β-蒎烯(1%～43%)是主要成分，且两者在每个样品中的总含量超过70%，有明显的地理变异，而α-侧柏烯、β-金合欢烯、β-澄椒烯也首次在针叶中被发现。杨燕等(2009)同样用水蒸气蒸馏法，发现松针挥发物了53种化合物，鉴定出50种成分，不仅包括单萜类(α-蒎烯、β-蒎烯、β-月桂烯、柠檬烯、香桧烯、异松油烯，含量为7.77%)和倍半萜类物质(α-古巴烯、双环榄香烯、α-荜澄茄烯、β-榄香烯、大根香叶烯D等16种，含量27.23%)，而且还有醇类物质11种(0.26%)、醛类物质2种(3.98%)、烷烃类物质3种(1.79%)、有机酸类6种(25.66%)、脂类物质3种(3.34%)、以及含氮化合物2种(20.24%)。殷彩霞等(2002)则用石油醚萃取并解析了云南松松针和松梢的挥发物组成，发现两者均有13种成分，仅有α-蒎烯、β-蒎烯、β-月桂烯、莰烯、3-蒈烯、香桧烯等6种化合物与上述成分相同，α-蒎烯同样具有最高含量，在松针和松梢中分别含有9.14%和47.13%。赵涛等(2002)则用正己烷萃取树干韧皮部的挥发物，但仅鉴定出10种成分，有6种成分出现在针叶挥发物中，而α-蒎烯的含量高达90.43%，为唯一的优势化合物。尹晓兵等(2007)分析了不同云南松种源间松脂的挥发性成分，发现其单萜类(31.9%～57.3%)和倍半萜类(41.8%～68.0%)含量高，单萜类物质能够反应云南松地理种源的遗传距离，尤其是α-蒎烯和β-蒎烯，这与丁靖凯等(1987)的结果相一致；双萜类含量较为稳定，含量0.3%～4.9%，以长叶松酸、左旋海松酸和新枞酸为主，但与种源的遗传距离关系不大。在本文结果中，发现云南松针和松脂挥发物中仅有萜烯类物质，尤其针叶中的单萜类物质，含量达到99.98%，而松脂中成分也在其它研究中均被发现，只是不含有分子量相对较大、沸点较高，或者其它来源的次生代谢物质(殷彩霞等, 2002; 杨燕等, 2009)，考虑到溶剂萃取对溶解物质的选择性以及水蒸气蒸馏容易损失低沸点和水溶性组分，本文所采用的顶空动态法，更近似于云南松在自然生境中所释放的挥发物，也更利于筛选云南切梢小蠹寄主选择或者取食和繁殖过程中所利用的挥发物成分，这也在众多的植物-昆虫-天敌组成的三级营养系统中被广泛验证(Agelopoulos and Pickett, 1998; Faccolietal., 2008; Munroetal., 2020)。另一方面，松属植物所释放的萜烯类物质，不仅仅是小蠹虫寄主定位的引导信号，更重要是植物的防御性反应，即抵御害虫或病原微生物侵入自身的防御系统(Gershenzon and Dudareva, 2007; Romónetal., 2017)，且一些研究已证实α-蒎烯、β-蒎烯和柠檬烯含量越低，越有利于小蠹侵入寄主(Lieutieretal., 2015; Romónetal., 2017)，这与本文研究结果高度一致(表1)。同时，萜烯类物质也有着明显的地理变异和季节差异性(丁靖凯等, 1987; Hengxiaoetal., 1999; 尹晓兵等, 2007; Romónetal., 2017)，特别是在一些区域内，由于云南松含有较高含量的β-蒎烯和柠檬烯，可以更好的抵御云南切梢小蠹的攻击，正如云南楚雄紫溪山的云南松很少受害，就是一个很好的例证。

3.2 云南切梢小蠹利用的活性成分与生态功能

截止目前，仅发现单萜类物质α-蒎烯、β-蒎烯、β-水芹烯和3-蒈烯对云南切梢小蠹具有活性功能，这也与大小蠹Dendroctonusspp.、齿小蠹Ipsspp.、地中海切梢小蠹T.destruens以及横坑切梢小蠹T.minor等所利用的寄主成分相同(李丽莎等, 1993; 殷彩霞等, 2002; 闫争亮等, 2011; Hofstetteretal., 2012; Lieutieretal., 2015)，但云南切梢小蠹对挥发物成分的趋向性并不相同。例如，李丽莎等(1993)采用小容器生测法发现α-蒎烯和3-蒈烯具有正趋向性，趋向率可达到95%，但林间无法诱捕到云南切梢小蠹。殷彩霞等(2002)则发现单一的α-蒎烯、β-蒎烯、β-水芹烯和3-蒈烯对对云南切梢小蠹没有趋性，但按照20.6 ∶4.7 ∶6.6 ∶1的配比则对云南切梢小蠹有60.5%的引诱比率。闫争亮等(2011)发现蛀梢期的云南切梢小蠹对松梢挥发物表现出一定的正趋向性，对树干挥发物则出现驱避性，而此时树梢挥发物以α-蒎烯(29.20%)和β-水芹烯(30.52%)为主，树干以α-蒎烯(81.01%)和3-蒈烯(6.66%)含量最高，说明着云南切梢小蠹的行为选择性与挥发物组成和浓度依赖有关。在本文中，云南切梢小蠹对针叶和松脂挥发物成分既有正趋向性，又有负趋向性，考虑到针叶和松脂挥发物的空间分化，预示着云南切梢小蠹对为害部位具有明显的选择特性，这与地中海切梢小蠹对寄主植物—意大利五针松P.pinea的松梢和树干的选择性是一致(Faccolietal., 2008)。与其它切梢小蠹一样，云南切梢小蠹在蛀梢时补充营养，完成卵巢的发育；在蛀干时，则进行交尾和产卵，完成生殖目的。结合初侵染云南松针叶和松脂挥发物成分及其空间分布，云南切梢小蠹的趋向性差异可能与信息化学物质的空间异质性直接有关，这样有利于寻找适宜的寄主，提升自我的繁殖适合度(Lieutieretal., 2015)。因此，下一步结合云南松挥发物的空间分化特征，并考虑其地理变异的特性，在不同区域内调整、优化化合物的组成和配比，才可能解决林间无法诱捕到云南切梢小蠹的难题，实现云南切梢小蠹种群的理化调控和可持续控制。