抗菌药物快速表型药敏检测技术研究进展*

吴秀祯，李姝丽，王志贤，盛长忠，周泽奇，陈龙(1. 天津市侵袭性真菌病精准诊断技术企业重点实验室，天津00480；2. 丹娜(天津)生物科技股份有限公司，天津00480；. 天津大学医学工程与转化医学研究院，天津 0084)

随着广谱抗菌药物的广泛应用，临床上出现越来越严重的抗菌药物耐药问题。世界卫生组织已将抗菌药物耐药视为“当今全球健康、粮食安全和人类发展面临的最大威胁之一”[1]。导致抗菌药物耐药的重要原因之一是抗菌药物的不合理应用。为有效遏制抗菌药物耐药性的蔓延，重在实现感染性疾病的早期精准诊断与治疗，即在病原微生物种属鉴定的基础上，根据抗菌药物敏感性试验(antibiotic susceptibility test，AST)结果选用抗菌药物，实现抗菌药物的合理应用。

目前，国内外广泛认可的AST标准化方法是纸片扩散法和稀释法。纸片扩散法是一种半定量药敏检测法，简便易行，但不能给出直观的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)，检测结果受多种因素影响。稀释法测定结果较准确，适用范围广，但操作繁琐，费时费力。目前，Vitek 2、Microscan Panel、BD Phoenix和Sensititre等商用自动化系统被广泛用于临床常规检测，珠海迪尔、山东鑫科、上海复星等企业也相继推出了国产自动化药敏检测系统。但上述常规方法均需要24～48 h从患者样本中纯培养分离出病原微生物，并需要6～72 h完成药敏试验，总耗时长达30 h～7 d，且难以应用于难培养或生长缓慢以及少见罕见的病原微生物。而临床上对感染性疾病的针对性治疗越早效果就愈好，对某些急性感染抢救的黄金窗口期仅为12 h。因此，发展快速药敏检测(rapid antibiotic susceptibility test，RAST)技术对临床医疗具有重大意义。

目前涌现了多种RAST方法，根据检测原理可分为基因型RAST和表型RAST。基因型RAST，包括PCR、基因芯片和基因测序技术等，可通过鉴定耐药基因来间接推测耐药的可能性，检测快速、灵敏；但其依赖于已知的耐药基因序列，故不能检测新的或不典型的耐药机制[2]。表型RAST依赖于以不同的抗菌药物温育病原微生物，直接评估抗菌药物能否抑制病原微生物生长，可作为基因型RAST的有效补充。因此，本文就近年来兴起的表型RAST技术的最新研究进展作如下综述。

1 单细胞形态分析技术

单细胞形态分析(single-cell morphological analysis，SCMA)技术是使用明视野显微镜监测系列浓度抗菌药物作用后单个病原微生物细胞的形态变化，然后采用自动图像处理算法对捕获的图像进行处理，获得生长细胞的面积、数量、长度等参数，进而通过图像分类算法计算得到抗菌药物的药敏数据的一种技术。

Choi等[3]设计了一种单细胞形态分析系统，该系统检测单元由连接到加药孔的简单通道组成，集成为96孔板。检测时，首先将病原微生物样品悬浮在37 ℃含琼脂糖的培养液中，加入通道中，当温度降至室温时，培养液在通道内形成凝胶并固定病原微生物；然后将抗菌药物溶液加入加药孔中，约5 min后，抗菌药物溶液完全扩散至凝胶中；最后用60×物镜在明视野显微镜下对固定的病原微生物进行成像，通过图像分类算法进行计算，可以在3～4 h内获得抗菌药物MIC值，这与标准的抗菌药物敏感性试验方法的一致性达91.5%。该系统还可用于血培养阳性样本的直接检测，从血培养瓶报阳到得到药敏结果仅需6 h[4]。Baltekin等[5]使用微流控芯片直接从低细菌浓度(104CFU/mL)的样本中捕获大肠埃希菌，并使用显微镜监测单个细菌的生长速率，从加样到结果读出，药敏试验总时间小于30 min。该系统已由Astrego Diagnostics公司开发上市(https://astrego.se/technology/)，适用于细菌和酵母样真菌的药敏检测。

2 荧光分析技术

基于荧光分析技术的抗菌药物敏感性检测需要对系列浓度抗菌药物作用后的病原微生物进行荧光标记，然后采用荧光显微镜或流式细胞仪对荧光进行检测，从而获得抗菌药物药敏数据。以下介绍4种主要的荧光分析方法。

2.1非放大数字成像法 基于所有类型细胞在受到蓝光照射时都发出黄绿色荧光这一原理，London等[6]开发了一种非放大数字成像法，该方法用蓝光照射微生物菌落，并在不放大的情况下将产生的细胞自身荧光定向到CCD芯片上，然后利用图像分析软件自动计算每个微菌落的光照像素簇。该技术将平板菌落总数的计数时间由24 h缩短至5 h。在该技术的基础上，First Light Diagnostics公司推出了用于微生物鉴别、快速药敏检测、毒素和生物标志物检测的全自动MultiPath平台(https://www.firstlightdx.com/)，该平台可直接用于临床样本的检测，通过靶向特异性荧光DNA探针标记和免疫磁珠分离技术结合，能在30 min内鉴别病原体，在4 h内获得药敏结果[7]。

2.2ATP生物发光法 ATP是主要的生物能量来源，普遍存在于所有活的生物体中，具有相当恒定的含量。通常细胞在凋亡、坏死或处于一些毒性状态下，ATP水平会下降。因此，可以通过ATP浓度的测定，反映微生物的活性和活细胞的数量。ATP检测的原理是在Mg2+存在和萤火虫荧光素酶的催化作用下，微生物细胞内释放出的ATP与荧光素反应产生荧光，荧光强度与ATP含量成正比，进而通过用荧光分光光度计测定的荧光强度来估算活的微生物数量。ATP生物发光法检测具有快速、简便、灵敏度高的优势，目前主要用于食品中微生物总数的测定[8]。

March-Rosselló等[9]将ATP 生物发光法用于细菌RAST检测。该方法的检测限为103CFU/mL。每次检测微生物ATP的时间可以控制在几分钟之内，2 h即可获得MIC值。然而该方法需要先裂解微生物，将ATP释放到溶液中后再进行检测，操作较复杂，且真菌细胞壁厚，裂解难度较大，可能影响检测灵敏度。Sun等[10]使用一种商业化BacTiter-Glo detection reagent试剂检测药物对肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌等临床分离株的药敏活性。抗菌药物作用后，无需ATP提取，仅需加入该试剂室温温育15 min后即可检测ATP含量，大大简化了操作流程，但该试剂是否适用于真菌药敏检测还有待研究。

2.3刃天青还原法 刃天青是一种蓝色染料，在还原条件下可以转化成一种粉红色荧光终产物试卤灵，后者常在细胞活力测定中用作氧化还原指示剂。在细胞增殖过程中，细胞内NADPH/NADP、FADH/FAD、FMNH/FMN和NADH/NAD的比值升高，处于还原状态。摄入细胞内的刃天青被这些代谢中间体及细胞色素类还原成试卤灵后释放到细胞外并溶于培养基中，使培养基从无荧光的靛青蓝变成有荧光的粉红色，最后用普通分光光度计或荧光光度计进行检测，吸光度和荧光强度与活性细胞数成正比。利用这种方法，March-Rosselló等[11]在2 h内绘制了葡萄球菌、肠球菌和大肠埃希菌的抗菌谱，检测限为106～108CFU/mL。Avesar等[12]开发了一种基于刃天青还原法的微流体芯片，可直接检测从尿液样本中分离的细菌，6 h内可获得MIC值。然而，刃天青的缺点是不被非发酵革兰阴性杆菌代谢，因此该方法无法用于所有病原微生物的药敏检测。

2.4活死细胞染色法 活死细胞染色是AST中常用的标记方法之一。SYBR Green I是一种渗透性染料，可将所有活细胞染成绿色，而碘化丙啶(PI)是一种非渗透性染料，只可将细胞膜受损的死亡或受损细胞染成红色。因此，通过荧光显微镜或荧光酶联仪测得绿/红荧光比值，表征细胞种群的存活状态。Feng等[13]利用SYBR Green染色活细胞、PI染色死细胞，在抗菌药物温育30 min后，即可检测各种快速生长的病原微生物的药敏活性，而生长慢的微生物则需要更长的温育时间。

3 纳米机械传感技术

抗菌药物效应可以通过检测微生物的微运动来判断。尽管有些微生物没有鞭毛或菌毛，但活菌体通常比死亡菌体表现出更高的内在运动。利用这一原理，将微生物附着在200 μm长的悬臂上，通过监测悬臂的运动来检测抗菌药物效应。Stupar等[14]设计了一种纳米机械传感器，将一束激光聚焦在传感器表面，通过接收反射光来监测悬臂运动。当无活菌附着在传感器上时，波动仅由热运动驱动，幅度很小；附着活菌后，波动幅度变大；抗菌药物作用后，敏感性细菌无法存活，波动恢复至较低水平。该系统检测限为105CFU/mL，在30 min内即可完成药敏检测。Villalba等[15]利用纳米机械传感器对生长缓慢的百日咳杆菌进行RAST检测，8 h内即可获得MIC值。该技术已由Resistell公司开发上市(https://resistell.com/)。

4 拉曼光谱技术

拉曼光谱技术是基于拉曼散射效应，对与入射光频率不同的散射光谱进行分析以得到分子振动、转动方面信息，并应用于分子结构研究的一种分析方法。由于拉曼光谱技术分析速度快、灵敏度高、样品所需量小，已广泛应用于生物化学[16]、安检安防[17]、考古勘探[18]、珠宝文物鉴定[19]、医药[20]检测等众多领域。

在微生物药敏检测领域，由于微生物在抗菌药物作用后，会产生一定的生化响应，如自身组成变化、代谢产物变化、同化速率变化等。通过拉曼光谱技术对这些变化进行检测，从而确定抗菌药物对微生物是否有效。Karanja等[21]采用受激拉曼散射成像技术对白念珠菌菌株中脂肪生成活性进行直接成像，可以在5 h内区分敏感菌株和耐药菌株。Moritz[22]、Kirchhoff[23]、Premasiri[24]等应用拉曼光谱技术在2 h内对细菌药敏进行了快速检测，但由于谱图需要利用专业软件进行统计分析，操作相对复杂。Tao等[25]利用拉曼结合重水标记，考察了不同抗菌剂对细菌活性的影响，并发展了基于细菌代谢活性的最小活性抑制浓度指标。检测中，重水中氘(D)参与微生物重要生物大分子的合成，从而在拉曼光谱的生物静默区出现一个明显的C-D峰。根据C-D峰的强弱及有无，即可判断病原微生物对抗菌药物的敏感性。

Yang等[26]通过联用单细胞拉曼和重水标记，利用抗菌药物作用下耐药菌和敏感菌“饮用”重水活性不同，在仅标记重水半小时后，即可根据氘相关拉曼特征峰判断细菌对抗菌药物的活性响应，筛选出有效抗菌药物。该方法从接收尿液到报告药敏结果的全流程，可在2.5 h内完成，远远快于尿道感染标准药敏检测方法所需的48 h。由于拉曼可以在单细胞水平进行检测，临床样本无需培养，也无需染色或标记，可直接用于药敏检测，克服了临床样本病原微生物数量少、需要冗长培养的难题，且适用于不可培养微生物的测定。这些研究表明拉曼光谱是一种非常有前景的快速药敏检测的工具，该技术越来越受到研究者的重视。目前国内已有中国科学院青岛生物能源与过程研究所、威朋(苏州)医疗器械有限公司和上海氘峰医疗器械有限公司等机构从事基于拉曼光谱技术的微生物快速药敏设备的开发。

5 异步磁珠旋转技术

异步磁珠旋转(asynchronous magnetic bead rotation，AMBR)是一种处于原理验证阶段的新型生物技术。磁珠可在磁场中异步旋转，任何物体黏附在磁珠上，均可改变其旋转速度。当微生物通过正负电荷吸附作用黏附在磁珠上生长时，尽管生长过程中出现的变化极其微妙，磁珠旋转遭遇的阻力却发生了明显变化，导致磁珠的旋转速度发生改变。因此，可根据磁珠旋转速度的变化来测定微生物生长出现的纳米级变化。

Kinnunen等[27-28]设计了一种AMBR传感器。检测时，将已知浓度细菌细胞与直径2.8 μm的磁粒子混合，37 ℃振荡温育10 min，再将溶液移入孔板，置于永磁体阵列上方5 min，以诱导磁粒子自组装到AMBR传感器中。每个AMBR传感器由大约106个磁粒子组成。光电二极管通过自阱板底部测量波动光来检测AMBR的旋转周期。当黏附在AMBR传感器上的细菌开始生长时，传感器的旋转周期延长。AMBR方法可以在大约1.5 h内评估小浓度细菌的初始生长情况，检测限为5×103CFU/mL。由于微粒对表面的黏附效应影响系统的效率和灵敏度，导致结果重现性不足。此外，这种设置较复杂，目前尚不适用于临床。

6 微流体技术

微流体(microfluidic)技术通过在芯片上建立一个复杂系统，利用微米级通道内的少量可控流体，实现微生物培养、核酸杂交和扩增、细胞裂解等多种功能。与现有的宏观检测方法相比，微流体技术有助于减少样品量、简化操作流程、缩短检测时间、提高检测灵敏度，并有可能提高整个系统的适用性。一些研究小组已经开发了微流体RAST平台，这些设备可以利用通道、微流体陷阱或水凝胶板产生离散或连续的药物梯度[29]。

6.1离散梯度稀释法 Kim等[30]设计了一种简单、经济、快速进行RAST的微流体芯片，将标准肉汤微量稀释法缩小到20 mm×20 mm微流体装置上。检测时，将含或不含抗菌药物的细菌(5×105CFU/mL)悬浮液分别注入2个加样孔，通过变动通道的长度来改变液体流速，从而产生非连续的浓度梯度，故称离散梯度稀释法。不同浓度的抗菌药物再进入后续的培养小室，然后使用相差显微镜监测各培养小室内的细菌数量。利用该平台，在3 h内可测定大肠埃希菌菌株对氨苄青霉素和链霉素的MIC值。

6.2连续梯度稀释法 Hou等[31]将含有均匀分散细菌(5×106CFU/mL)的低温琼脂糖注射入放置在倒置显微镜上方的微流体培养装置中，凝胶凝固后，将含或不含抗菌药物的培养基注入凝胶两侧的2个通道，形成稳定连续的抗菌药物梯度，故称连续梯度稀释法。使用CCD相机拍摄延时图像，分析单细胞的生长情况，并与温育时间绘制成生长速率曲线，进而确定MIC值。使用该装置可以在2.5～4 h获得MIC值。该系统的一个优点是以连续梯度测量抗菌药物的生长抑制，可以给出更精确的MIC值。

7 总结与展望

目前，常规药敏检测和自动化技术仍是当今临床微生物实验室AST检测的主要方法。由于这些方法易于使用，成本相对较低，预计在未来一段时间内仍不可或缺。然而，随着多重耐药菌感染率与耐药率的逐年增高，为遏制抗菌药物耐药问题，提高抗菌药物合理利用的程度，RAST将是未来临床实验室病原微生物药敏检测的必然趋势。理想的RAST应能直接用于临床样本以及生长缓慢和不可培养微生物的检测；检测时间应控制在4 h内，以便在同一班次内为临床医生提供用药指导；能够实现检测自动化，减少人工操作，提高检测效率；高通量检测，能够满足临床多样本同时检测的需求[32]。

本综述讨论的RAST技术中(见表1)，ATP检测需要裂解细胞，难以适用细胞壁厚的真菌；刃天青染色法无法用于所有病原微生物的检测；异步磁珠旋转技术所需设备较复杂。这些技术在RAST领域的应用还需要进行不断的技术改进。相比而言，拉曼光谱技术不但可以在2 h内完成药敏检测，而且还能生成微生物唯一的“全生物体拉曼指纹图谱”用于病原微生物的快速鉴定，可同步实现病原微生物鉴定和快速药敏检测，将是未来RAST的主力；微流体技术将检测缩小到一个很小的芯片上，仅需少量的样品和试剂就能实现检测，具有高通量、自动化的特点，该技术与其他检测技术的有机结合，将有助于开发出新的RAST技术。

表1 快速表型药敏检测技术比较

若将拉曼光谱技术与微流体技术相结合，利用微流体技术产生微量抗菌药物梯度用于病原微生物的培养，然后利用拉曼光谱技术检测病原微生物产生的拉曼指纹图谱，可实现微生物鉴定和药敏活性的快速检测。该技术具有所需检测样本量少、操作简便、耗时短等突出优势，将成为新一代强大的RAST工具。该技术一旦成功，可直接用于临床样本及血培养阳性样本的检测，大大缩短微生物鉴定和药敏检测时间。

目前，国内外广泛认可的抗菌药物敏感试验标准化方法主要有美国临床和实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)和欧洲抗菌药物敏感试验委员会(The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing，EUCAST)发布的最新抗菌药物敏感试验方法。为获得与这些现行金标准技术一致的药敏检测结果，RAST新技术需要不断在临床实验中获取数据，建立新的检测标准。