不同样本保存条件对鼻咽拭子呼吸道病原体核酸检测的影响

王博文，李国凯，杨莉，彭凯歌，刘畅，拉姆次仁，黄英眉，马盼盼(西藏军区疾病预防控制中心传染病防控科，拉萨 850000)

呼吸道病毒感染是临床常见的疾病之一，其发病率和死亡率常年居高不下。西藏地区平均海拔超过4 000米，氧气含量少，空气湿度低，恶劣的高原气候极易引起机体免疫力下降[1]，呼吸道感染的发病率更高。目前临床上普遍采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction, qPCR)法对患者的鼻咽拭子样本进行核酸检测，该方法具有高通量、高灵敏度和高特异性的特点，对呼吸道感染的病原学诊断具有重要意义[2]。部队作为一个特殊群体，执行任务量多，人口流动性大，生活密集度高，呼吸道感染往往密集发病，严重影响战斗力。西藏边防单位医疗设施落后，绝大多数无法进行呼吸道病原体核酸检测，需要将样本暂时保存并运送至上级医疗单位进行检测。而西藏地域面积广袤，地理环境复杂，样本转运时间长。不同样本保存条件对呼吸道病原体核酸检测是否会产生影响，目前鲜见报道。本研究收集了12位腺病毒、支原体、甲型流感病毒或乙型流感病毒检测阳性患者的鼻咽拭子样本，设计不同的保存条件，对比保存前后样本qPCR的检测结果，为边防官兵科学合理地进行样本保存和运输提供数据支撑。

1 材料和方法

1.1研究对象 收集2020年1月至2月西藏军区总医院就诊且腺病毒、支原体、甲型流感病毒或乙型流感病毒鼻咽拭子核酸检测阳性的患者鼻咽拭子样本各3份，共计12份。

1.2试剂与仪器 MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit(TaKaRa公司)，腺病毒、支原体、甲型流感病毒和乙型流感病毒核酸检测试剂盒(北京金豪制药公司)，病毒采样管(中国友康生物公司)，Rotor Gene Q实时荧光定量PCR仪(德国Qiagen公司)。

1.3方法

1.3.1样本采集 咽拭子采集：用聚丙烯纤维头的塑料杆拭子擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁取样，将拭子头浸入采样液中，尾部弃去，旋紧采样管螺旋口；鼻拭子采集：将聚丙烯纤维头的塑料杆拭子轻轻插入鼻道内鼻腭处，停留片刻后缓慢转动退出，将拭子头浸入同一采样管采样液中，尾部弃去，旋紧采样管螺旋口。

1.3.2样本灭活温度梯度和时间梯度设置 取上述不同的鼻咽拭子样本，每份样本混匀后分装24支，每支120 μL。置于恒温水槽和冰箱中，分别于20 ℃(室温)、4 ℃、-20 ℃和-80 ℃不同温度条件下保存6 h、12 h、24 h、48 h、96 h和192 h。未保存样本(0 h)和保存完毕后的样本进行后续核酸提取。

1.3.3核酸提取和病原体qPCR检测 用病毒RNA/DNA提取试剂盒提取核酸，每个样本提取需100 μL采样液，其余按照说明书操作。用腺病毒、支原体、甲型流感病毒和乙型流感病毒核酸检测试剂盒，在Rotor Gene Q实时荧光定量PCR仪上进行qPCR试验，按照试剂盒说明书进行操作。所有检测均需重复3次，取平均循环阈值(cycling threshold，Ct)进行统计分析。

1.3.4核酸检测结果判读 样本循环曲线为“S”形曲线才能计算Ct值。若样本Ct≤37，结果判定为阳性；若3742，结果判定为阴性。每次qPCR共进行50个循环，若样本在50个循环内仍未显示“S”形曲线，则记录样本Ct为50.00。

2 结果

2.1患者基本信息 患者的性别、年龄、病原学诊断、核酸类型和Ct值见表1。

表1 患者基本信息

2.2不同保存时间对20 ℃(室温)样本qPCR结果的影响 12份20 ℃保存样本不同保存时间处理后的qPCR结果分析见表2。对于腺病毒和支原体，与0 h结果相比，20 ℃保存6 h、12 h、24 h以内Ct值差异无统计学意义(P>0.05)，保存48 h(P<0.05)、96 h(P<0.01)和192 h(P<0.001)时样本Ct值明显升高。对于甲型流感病毒和乙型流感病毒，20 ℃保存12 h以下不会引起样本Ct值变化(P>0.05)，保存24 h以上均会引起样本Ct值增大(P<0.05)。20 ℃(室温)条件下，腺病毒、支原体、甲型流感病毒和乙型流感病毒阳性样本随着保存时间延长均会出现不同程度的阳性程度减弱甚至假阴性。

表2 不同保存时间对20 ℃(室温)样本Ct值的影响

2.3不同保存时间对4 ℃样本qPCR结果的影响 12份4 ℃保存样本不同保存时间处理后的qPCR结果分析见表3。对于腺病毒和支原体，4 ℃保存96 h以内不会引起样本Ct值变化(P>0.05)，保存192 h可引起样本Ct值明显升高(P<0.05)。对于甲型流感病毒和乙型流感病毒，4 ℃保存48 h以下不会引起样本Ct值变化(P>0.05)，保存96 h(P<0.05)和192 h(P<0.01)均会引起样本Ct值增大。4 ℃保存时，腺病毒和支原体样本会逐渐出现阳性减弱，甲型流感病毒和乙型流感病毒仍会出现假阴性结果。

表3 不同保存时间对4 ℃样本Ct值的影响

2.4不同保存时间对-20 ℃样本qPCR结果的影响 12份-20 ℃保存样本不同保存时间处理后的qPCR结果分析见表4。对于腺病毒和支原体，-20 ℃保存192 h以内均不会引起样本Ct值变化(P>0.05)。对于甲型流感病毒和乙型流感病毒，-20 ℃保存96 h以下不会引起样本Ct值变化(P>0.05)，保存192 h会引起样本Ct值增大(P<0.05)。-20 ℃保存时，所有样本几乎不会出现假阴性结果。

表4 不同保存时间对-20 ℃样本Ct值的影响

2.5不同保存时间对-80 ℃样本qPCR结果的影响 对于腺病毒、支原体、甲型流感病毒和乙型流感病毒，与0 h样本比较，-80 ℃保存192 h以内样本Ct值差异均无统计学意义(P>0.05)。-80 ℃保存时，所有样本的阳性程度几乎没有变化。

3 讨论

有报道称，80%以上的高原呼吸道疾病是由非细菌性病原体引起的，其中，腺病毒、肺炎支原体、呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒和乙型流感病毒较为常见[2-3]。目前，qPCR检测已经成为呼吸道病原学诊断的主流方法，如何能够科学有效地进行样本保存和运输对于后续检测至关重要。本研究中所使用的友康生物病毒保存液，在Hank′s基础之上，添加HEPES等稳定病毒成分，可在较宽的温度范围内维持病毒的活性，大大降低了病毒的分解速度。即便如此，厂家推荐的样本运送及保存时间仍不超过48 h，无法满足西藏边防官兵样本运送的需要。

研究发现，DNA病原体和RNA病原体在同样的保存条件下，核酸检测结果不尽相同。对于20 ℃保存温度，DNA可以在24 h保持稳定，而RNA只能保持12 h；4 ℃保存温度可以使稳定时间延长，DNA可以在96 h内保持稳定，而RNA只能保持48 h；-20 ℃温度下，DNA可以持续保持稳定，RNA会在192 h改变；-80 ℃条件下DNA和RNA均能保持稳定。这可能与不同核酸类型结构稳定性不同有关[4]。因此，为了保证qPCR检测的灵敏性和稳定性，避免呼吸道病原体的漏检误检，建议对于鼻咽拭子样本的保存运输时，应尽量使样本处于低温。目前，西藏边防官兵进行样本运送时普遍没有改变样本储存条件的意识。很多单位仍然采用常温运送样本，对呼吸道病原体筛查造成了巨大困难[3]。结合实验结果，在拉萨附近可以保证24 h内将样本送达的单位，可以采用常温运送；需要48 h才能送达的单位，建议采用冰袋或冰盒运送；估计48 h内无法顺利将样本送达的单位，建议采购干冰进行运送。这样可以保证样本的质量，尽可能提高检出率。

同时，该实验研究也有一些缺陷。一方面，每种病原体样本只有3例，实验结果只能作为一个预实验，可能无法全面体现不同样本保存条件对呼吸道病毒核酸检测结果的影响。以后将进一步扩大样本量，尽可能纳入更多的呼吸道病原体类型和样本数量，获得更加可信的实验结果。另一方面，纳入的研究对象均为阳性样本，Ct值相对较低，样本病毒载量较高，对于弱阳性样本并没有纳入研究。结合实验结果，弱阳性样本可能对不同储存条件更加敏感，更容易随着储存时间的延长产生假阴性的实验结果。下一步将重点对弱阳性样本的储存条件进行深入研究。