巨尾桉精油对黑麦草、小麦种子的化感作用研究
2022-01-05孔庆博王小菊李佳佳罗思源丁春邦周莉君
孔庆博，杨 帅，王小菊，李佳佳，罗思源，丁春邦，周莉君
（四川农业大学生命科学学院，四川雅安 625014）
近年来，滥用化学除草剂使得很多杂草产生耐药性，同时也造成了环境污染和人畜健康隐患[1]。研究发现，苘麻（Abutilon theophrasti）、万寿菊（Tagetes erecta）和猪毛蒿（Artemisia scoparia）的精油及其化学成分对种子发芽和幼苗生长有强烈的化感作用[2-5]。利用植物化感作用代替化学合成除草剂是一个新的思路，因为它更加安全环保、高效且易降解。
化感作用是植物与其他生物之间产生次生物质相互影响的一种现象[6]。产生化感作用的次生物质被称为化感物质[7]。在自然状况下化感物质以自然挥发、雨淋液、根系分泌物以及枯枝落叶的分解等方式释放[8-10]。尤其在桉树林中化感作用普遍存在[11]。研究曾报道赤桉（Eucalyptus camaldensis）、柠檬桉（Eucalyptus citriodora）、蓝桉（Eucalyptus globulus）和尾叶桉（Eucalyptus urophylla）等多种桉树水浸液及精油的化学成分具有抑制桉树林下植物种子的发芽及幼苗生长的作用[12-16]。通过对植物间的化感作用研究，可进一步揭示植物种群、群落和生态系统的时空分布，对指导农林业生产规划有着重要的意义[17-18]。
巨尾桉（Eucalyptus grandis× E.urophylla）是桃金娘科（Myrtaceae）桉树属（Eucalyptus）人工授粉的杂交种，其杂交优势突出，已经成为我国桉树人工造林的主导品种。目前国内对巨尾桉的利用主要集中于经营性木材加工，文献报道了巨尾桉树叶、树皮和精油的成分的抗氧化、抑菌等生物活性[19-23]，但对巨尾桉叶精油的化感作用研究较少，其并没得到充分开发利用。
本研究采用水蒸气蒸馏法提取巨尾桉叶精油并进行GC-MS分析，以黑麦草、小麦为供试植物，使用不同质量浓度的巨尾桉叶精油测定化感作用相关的试验指标，为进一步利用巨尾桉叶精油开发环境友好型生物除草剂及农作物合理栽培提供参考。
1 材料和方法
1.1 材料与试剂
巨尾桉叶2020年5月采摘于中国四川眉山市洪雅县余坪镇（N 29°52′36.52″，E 103°29′17.51″）。将自然风干的叶子粉碎过筛并保存在4℃冰箱中，备后续试验。正己烷（色谱纯）、吐温（Tween）80、次氯酸钠、无水乙醇、石英砂、碳酸钙、硫代巴比妥酸以及三氯乙酸，所有试剂均购买于成都科龙化学试剂厂。
1.2 仪器与设备
UV-1900紫外分光光度计，岛津仪器（苏州）有限公司；电热恒温水浴锅，北京市永光明医仪器有限公司；SC-3614离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司。
1.3 精油提取
精准称取100 g巨尾桉叶干粉于圆底烧瓶，按1∶6的比例加600 mL蒸馏水混匀，连接蒸馏装置，加热提取5 h，待静置分层后加无水硫酸钠脱水收集精油，置棕色瓶中4℃下保存备用。精油得率公式如下：
精油得率=所得精油质量/所用桉叶质量×100%
1.4 GC-MS分析
精油用正己烷稀释至10 μL/mL，并用正己烷作为空白对照。
气相色谱条件：分析柱：HP-5MS柱子；升温程序：50℃ 保持6 min，以10℃/min升温速度升至120℃，保持5min；以8℃/min升至160℃，保持4min；再以12℃/min升至280℃保持5 min。载气为氦气，进样量：1 μL，分流 50∶1，进样口温度为 260 ℃，接口温度220℃。
质谱条件：电子轰击（EI）离子源，电子能量70 eV，电子倍增器电压1.5 kV，质量扫描范围40～550 amu，全扫描，进样量 1 μL。
数据处理及质谱检索：通过气相色谱-质谱联用仪提供的NIST MS质谱数据库进行分析确定其组成成分，并通过峰面积归一化法计算各成分的相对含量[24]。
1.5 化感作用的生物测定
1.5.1 植物种子准备及预处理
黑麦草（Lolium perenne L.）、小麦（Triticum aestivumL.）种子购买于农资店。选取大小一致、饱满且无虫害的种子，用0.5%次氯酸钠溶液对种子消毒5 min，蒸馏水洗净，滤纸吸干种子表面水分，以备后续使用。
1.5.2 种子萌发试验
采用培养皿法[13]，稍加改动。用1%吐温80溶液制备不同质量浓度（0.125、0.250、0.500、1.000 和 2.000 mg/mL）的巨尾桉叶精油溶液。在直径9 cm的培养皿中放2张已消毒的滤纸，试验组分别加入5 mL不同质量浓度精油溶液，对照组加入5 mL蒸馏水。待滤纸浸湿后将已消毒籽粒饱满大小均匀的黑麦草、小麦种子各40粒分别在滤纸上均匀铺开，立即盖上皿盖，并在培养皿的上方罩一个透光、透气的塑料罩，置于（26±2）℃培养室培养，光照12 h，黑暗12 h。为保证滤纸湿润，培养3 d后每隔2 d向培养皿中加2 mL试验组溶液和对照组溶液。以胚根或胚轴突破种皮1～2 mm为种子发芽标准，每天统计种子发芽数量，连续统计7 d（直到种子不再发芽为止）。计算最终发芽率、发芽势和发芽指数；并在第7天用数码显示游标卡尺测量幼苗的苗高及根长 (胚轴末端至根末端的长度)，各处理均重复3次，结果取平均值。
计算公式：
发芽率=发芽终期（第7天）正常发芽种子数/供试种子数×100%
发芽势=发芽初期（第3天）正常发芽种子数/供试种子数×100%
发芽指数=Σ（Gt/Dt），Gt为第t天的发芽数，Dt为相应的发芽天数
1.5.3 叶绿素含量的测定
采用分光光度计法[25]，稍加改动。称0.1 g叶片置研钵中，加入适量石英砂、碳酸钙及2mL95%乙醇充分研磨，研磨液转移到2 mL离心管中离心，10 000 r/min，2 min；取上清液加95%乙醇定容于50 mL容量瓶混匀，测定440、645和663 nm 3个波长的OD值。所有过程均在暗室中完成。
1.5.4 丙二醛含量的测定
参照王学奎[26]方法，稍加改动。称0.1 g叶片，加少许石英砂，加入5 mL 5%三氯乙酸研磨，将提取液4 000 r/min离心10 min；上清液保存备用；取3 mL上清液，加入0.67%硫代巴比妥酸（TBA）3 mL，混匀后沸水浴 30 min，冷却离心，4 000 r/min，8 min。测定450、532和600 nm 3个波长上清液的OD值。
1.6 数据分析
化感作用响应指数（RI）[27]表示化感作用强弱。当 T≥C，RI=1-C/T；当 T
试验数据采用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析及显著性检验（P<0.05），用Graphpad 8.0软件对数据进行整理分析，均重复3次。
2 结果与分析
巨尾桉叶精油提取率为0.58%，密度为0.89 g/mL。通过GC-MS对巨尾桉叶精油进行检测分析，采用面积归一化法确定各成分相对含量。由表1所示，该精油鉴定出36种成分，占精油总量的92.076%。巨尾桉叶精油主要包含萜类、酯类、醇类和酮类等成分，含量最多的是萜类占61.372%，其中萜类含量最高的是桉叶油醇；其次酯类含量最多的是乙酸松油酯可达到24.604%，而含量最低是酮类的植酮只占0.405%。
表1 巨尾桉精油成分及相对含量Table 1 Composition and relative content of Eucalyptus grandis×E.urophylla essential oil
续表1
2.1 巨尾桉精油的化感活性
2.1.1 巨尾桉精油对种子萌发的影响
巨尾桉精油对2种种子最终发芽率的影响如表2所示。在不同质量浓度的精油处理下，黑麦草和小麦种子的最终发芽率均受到了抑制影响。与对照组相比，种子的最终发芽率均表现为质量浓度越高抑制效果越强，并且在精油质量浓度为2.000 mg/mL处抑制效果最大。根据表2数据分析，巨尾桉精油对黑麦草、小麦种子萌发的半抑制质量浓度（IC50）为1.000 mg/mL。
表2 巨尾桉精油对种子萌发的影响Table 2 Effect of Eucalyptus grandis×E.urophylla essential oil on germination of seeds
从表2中可以看出，巨尾桉精油具有降低黑麦草、小麦种子的最终发芽势的作用。与巨尾桉精油的质量浓度呈一定的依赖关系，尤其在2.000 mg/mL处，黑麦草发芽势仅为10.83%。可见，2.000 mg/mL的巨尾桉精油对2种植物种子最终发芽势均有显著影响（P<0.05）。
一般情况下，发芽指数越高说明该种子发芽所需要的时间越短，发芽速度越快。由表2可见，各质量浓度处理组的黑麦草、小麦种子发芽指数均低于对照组。说明巨尾桉精油对黑麦草、小麦种子的发芽速率均有一定的抑制作用。随着精油质量浓度的提高，种子的发芽指数不断降低。其中在2.000 mg/mL质量浓度处理下，黑麦草和小麦种子的发芽指数均最低，与对照组有极显著差异（P<0.05）。
2.1.2 巨尾桉精油对种子幼苗生长的影响
幼苗生长与苗高、根长有关。如图1A所示，巨尾桉精油对2种种子的苗高生长均有抑制作用，且呈现明显的质量浓度依赖性，其中黑麦草对巨尾桉精油的敏感度要比小麦强，可见影响抑制效果与种类有关。如图1B可见，黑麦草和小麦的根长随着巨尾桉精油质量浓度的增加而减小。根据方差分析，各处理组间2种种子幼苗的苗高、根长存在显著差异（P<0.05），说明巨尾桉精油对黑麦草、小麦幼苗的生长有一定的抑制作用。
图1 巨尾桉精油对种子幼苗生长的影响Figure 1 Effect of Eucalyptus grandis×E.urophylla essential oil on the seedling growth
2.1.3 巨尾桉精油对幼苗叶绿素、丙二醛含量的影响
叶绿素含量与光合作用紧密相关，光合作用的强弱又影响到植物的生长。如表3所示，不同质量浓度的巨尾桉精油对2种种子幼苗叶绿素a、b含量产生影响。黑麦草叶绿素a的含量除了在0.250 mg/mL质量浓度外，其他质量浓度间与对照相比，差异显著（P<0.05），其中0.125 mg/mL质量浓度下表现出促进作用，而其他质量浓度均为抑制作用。小麦叶绿素a含量最低出现于1.000 mg/mL质量浓度处，与对照相比，显著降低了29.1%（P<0.05）。但从表3可见，黑麦草叶绿素b含量变化没有明显的规律可循，与对照相比，只有0.500 mg/mL质量浓度存在差异（P<0.05）；但小麦的叶绿素b含量除了0.125 mg/mL质量浓度下不存在显著差异，其他处理组与对照差异显著（P<0.05）。
表3 巨尾桉精油对幼苗叶绿素、丙二醛含量的影响Table 3 Effect of Eucalyptus grandis×E.urophylla essential oil on chlorophyll and malondialdehyde content in seedlings
丙二醛含量是植物细胞膜质过氧化程度的体现，如表3所示，黑麦草幼苗在不同精油质量浓度处理下，丙二醛的含量随着质量浓度的增加而增大，与对照组相比差异显著（P<0.05），而小麦幼苗仅在0.500～2.000 mg/mL质量浓度范围内与对照组存在显著差异（P<0.05），说明巨尾桉精油处理后，2种植物细胞膜质过氧化程度升高，细胞膜受到的伤害随着质量浓度的升高逐渐加重。
2.1.4 巨尾桉精油对2种种子的化感响应指数
化感响应指数（RI）是衡量化感作用强度的指标，RI>0，为促进，RI<0，为抑制[27]。由图 2 可见，巨尾桉精油对黑麦草（图2A）、小麦（图2B）种子的不同生理指标有不同的化感响应指数。除叶绿素a、b个别情况以及丙二醛含量外，2种种子的其他生理指标化感响应指数均为负值，化感响应指数的大小与质量浓度的大小呈依赖关系。而2种种子的丙二醛化感响应指数为正值，则说明丙二醛含量增加，代表2种植物的细胞膜质过氧化程度升高，细胞膜受到的伤害逐渐增大。
图2 巨尾桉精油对2种种子化感响应指数Figure 2 Allelopathic response index of Eucalyptus grandis×E.urophylla essential oil to two seeds
3 讨论与结论
本研究在巨尾桉叶精油化学成分分析中发现桉叶油醇（19.843%）、蒎烯（15.517%）和 α-松油醇（10.294%）等萜类物质相对含量占总精油的61.372%，是巨尾桉叶精油的主要组成成分，除此之外还有乙酸松油酯（24.604%）、植酮（0.405%）及醇类等。Zhou L.J.等[22]采用超临界CO2流体萃取法对3年生的巨尾桉叶提取8 h，其主要成分为桉叶油醇（45.57%）和α-蒎烯（24.78%）；A.Lucia等[28]评估了阿根廷巨桉的主要成分是α-蒎烯（52.71%）和桉叶油醇（18.38%），这些差异可能是由于生长环境，提取方法甚至生长年限和收获季节引起的。先前报道称，萜类[13，29-31]、酯类[32]等次生代谢物是具有化感作用的物质。马瑞君等[33]研究结果表明，黄帚橐吾（Ligularia virgaurea（Maxim.）Mattf.ex Rehd.&Kobuski）的挥发物（含有大量的萜类物质）对5种牧草种子均有化感作用，并证明其化感作用与萜类物质有关。S.Benchaa等[13]对柠檬桉（Eucalyptus citriodora）叶精油化学成分及化感作用进行研究，发现柠檬桉叶精油主要以萜类成分为主，其中香茅醛是最丰富的化合物（64.7%），香茅醇（10.9%）次之，并且其柠檬桉叶精油对杂草种子呈现化感抑制作用；N.Zahed等[31]对柔毛肖乳香（Schinus molle L.）叶和果精油成分和化感活性进行了检测，发现这两种精油成分也是以萜类为主，其对小麦的化感作用呈现浓度效应，且对小麦萌发和幼苗生长抑制效果较强；G.A.Ben等[6]同样研究发现桉树（Eucalyptus erythrocorys）粗提物对小麦及杂草种子的萌发、幼苗生长均有抑制作用，抑制作用强度随提取物质量浓度呈剂量效应；张晓芳等[32]研究表明白三叶草（Trifolium repens L.）挥发物对杂草有化感作用，其挥发性成分以烯和酯类化合物为主；有相关文献报道，用精油处理植物会使其叶绿素含量减少[2，34]，丙二醛含量增加[34]，结合本研究发现，在不同质量浓度的巨尾桉叶精油处理下，黑麦草、小麦幼苗的叶绿素含量随着浓度增加而减少，并且黑麦草、小麦幼苗的丙二醛含量随着浓度的增大而增大；同时，经巨尾桉叶精油处理后黑麦草、小麦种子的最终发芽率、发芽势、发芽指数以及幼苗的生长总体上均低于对照，各指标均随巨尾桉叶精油质量浓度的增加不断减小，这都与先前的研究结果相一致。
综上所述，本研究初步证实巨尾桉叶精油对黑麦草、小麦具有化感作用，然而具体是巨尾桉叶精油中的何种化合物或是几种化合物的协同导致的化感作用还需进一步深入研究，以此来充分发掘巨尾桉叶精油在生物除草应用方面的潜力。
