新型国产改良Middlebrook液体培养试剂对结核分枝杆菌培养效果的评价

徐银娟 赵国连 崔晓利 王佩 谈小文 杨珊珊 伍浩

早发现、早诊断、早治疗是结核病的防治共识。分枝杆菌培养及菌种鉴定是结核病病原学诊断的金标准，是确定结核病诊断和化疗方案的重要依据。BACTEC MGIT 960(简称“ MGIT 960”)系统是目前应用最广泛的分枝杆菌快速培养方法之一，但因其为进口试剂，存在价格昂贵、培养成本较高的问题，增加了结核病患者的经济压力，也使得一些基层医院无法开展此项工作，明显影响了结核病的及时诊治和增加了疾病传播的风险。因此，研发经济有效的分枝杆菌快速培养方法对我国结核病防治工作意义重大。

近年来，由我国自主研发的新型改良培养试剂相对于进口试剂具有价格低廉的优势，已被国内较多实验室使用，但对其检测性能的评价报道不多。因此，笔者以MGIT 960培养为参照标准，评价新型国产改良Middlebrook液体培养试剂对分枝杆菌进行培养的检测效能，为其在基层医疗机构的应用推广提供参考。

材料和方法

一、标本采集

采集2021年3—4月西安市胸科医院诊治的疑似肺结核患者痰液标本和肺泡灌洗液标本，对其中质量合格的89份痰液标本和61份肺泡灌洗液标本进行分枝杆菌改良试剂(Middlebrook液体培养试剂)培养(改良试剂法)和MGIT 960培养。

二、试剂和仪器

1.培养试剂：分枝杆菌改良培养试剂、改良生长添加剂及杂菌抑制剂均由广东希格生物科技有限公司生产。MGIT 960培养试剂、MGIT 960生长添加剂及杂菌抑制剂均为美国BD公司产品。

2.鉴定试剂：采用MPB 64结核分枝杆菌抗原检测试剂盒(杭州创新生物检控技术有限公司)和抗酸染液(珠海贝索生物技术有限公司)。

3.自配标本消化液：N-乙酰-L-半胱氨酸-4%氢氧化钠(NALC)和磷酸盐缓冲液(PBS，pH=6.8)。

4.实验仪器：BACTECTMMGITTM960 全自动分枝杆菌快速培养仪。

三、研究方法

1.肺结核诊断：参照《WS 288—2017 肺结核诊断》[1]标准。

2.标本处理：液化标本，视标本性状加入1～2倍体积的NALC于涡旋震荡器中震荡1 min，使痰标本充分均匀化，室温静置18 min后加入PBS，3000×g离心20 min，弃上清后加入1 ml PBS缓冲液，震荡混匀后静置10 min。再取0.5 ml上清液分别接种于MGIT 960 液体培养基和改良试剂液体培养基中，混匀，放入MGIT 960系统孵育屉中培养，由仪器自动监测并报告结果，最长观察时间为42 d。

3.结果判读：当MGIT 960培养系统超过42 d仍报告阴性，且肉眼观察无细菌生长时，则报告为分枝杆菌阴性。当培养系统报告为阳性时，则使用涂片抗酸染色进一步确认，若仅发现抗酸染色阴性菌，则报告为培养阴性，且将该培养管登记为“污染”管；若未发现抗酸杆菌则报告为阴性；若发现抗酸杆菌，再使用MBP64抗原检测试剂(胶体金法)进行结核分枝杆菌鉴定。

4.观察指标：记录两种方法培养阳性数、污染数和报阳时间(d)。

四、统计学处理

使用SPSS 18.0软件进行数据的统计分析。计数资料采用“百分率(%)”描述，组间差异的比较采用McNemar配对χ2检验，检测效能采用Kappa检验。计量资料呈偏态分布，采用“中位数(四分位数)[M(Q1，Q3)]”描述，组间差异的比较采用Wilcoxon符号秩和检验。均以P<0.05为差异有统计学意义。比较改良试剂法和MGIT 960培养法检测分枝杆菌的阳性率、污染率和报阳时间的差异，并以MGIT 960培养结果为参照标准，评价改良试剂法的检测效能。评价指标：敏感度(%)=真阳性份数/(真阳性份数+假阴性份数)×100%；特异度(%)=真阴性份数/(真阴性份数+假阳性份数)×100%；阳性预测值(%)=真阳性份数/(真阳性份数+假阳性份数)×100%；阴性预测值(%)=真阴性份数/(真阴性份数+假阴性份数)×100%，阳性似然比=敏感度/(1-特异度)，阴性似然比=(1-敏感度)/特异度。一致性检验标准：Kappa值≤0.40时，表明一致性较差；0.400.80时，表明一致性好。

结 果

一、两种分枝杆菌培养法的检测结果

改良试剂法检测痰液和肺泡灌洗液结核分枝杆菌的总阳性率和各自阳性率，以及总报阳时间和各自报阳时间与MGIT 960培养结果的差异均无统计学意义。两种方法检测灌洗液标本均无污染出现，但改良试剂法检测痰液标本的污染率(12.4%)明显高于MGIT 960(4.5%)，差异有统计学意义，见表1。

表1 两种培养法检测两种标本结核分枝杆菌的阳性与污染情况

二、改良试剂法的检测效能

以MGIT 960培养结果为参照标准，改良试剂法检测痰液和肺泡灌洗液标本结核分枝杆菌的效能见表2。两种方法进行培养的一致性好，其中检测痰液标本的Kappa值为0.907，检测肺泡灌洗液标本的Kappa值为0.902。

表2 改良试剂法以MGIT 960培养结果为参照标准对痰液和肺泡灌洗液标本结核分枝杆菌的检测效能

三、两种液体培养基成本情况

改良培养试剂的成本为(49.6±10.5)元/份，MGIT 960试剂成本为(75.4±15.8)元/份，前者培养试剂的价格仅约为后者的60%。

讨 论

近年来，随着分子生物学诊断方法的发展，结核病的诊断时间被大大缩短，但是分枝杆菌培养对于表型药物敏感性试验及涂片阴性结核病患者的检测依然必不可少[2]。目前，分枝杆菌MGIT 960液体培养因其全自动化结果判读系统准确度高、能够增加实验室周转速度而被推荐为结核病诊断金标准[3]，但其液体培养试剂培养管(美国BD公司)和另一种常用Bac T/Alert 3D培养管(法国生物梅里埃公司)均为国外研发产品，存在价格昂贵、运输不便等问题，严重消耗着我国的医疗卫生资源。这也为我国自主研发的新型改良分枝杆菌液体培养试剂(Middlebrook液体培养试剂)提供了应用空间。该试剂现已被多家机构使用，其价格低廉、便于运输，具有良好的应用价值，但与MGIT 960培养相比较，尚缺乏临床数据的对比研究。

本研究使用150份痰液和肺泡灌洗液临床标本，经过统一的前处理方法，将标本混悬液按照相同量分别加入到两种培养试剂中进行培养。结果显示，改良培养试剂法与MGIT 960培养对两种标本结核分枝杆菌的检测阳性率无明显差异，说明改良试剂法对结核分枝杆菌的检出能力与MGIT 960培养不相上下；进一步参考杨顺利等[4]对MGIT 960、Bac T/ALERT 3D和改良罗氏培养方法检测痰标本的阳性率结果(分别为45.34%、42.27%和40.11%)，可以认为本研究国产改良培养试剂对分枝杆菌的检出能力要优于其他类型的培养试剂。同时，改良培养试剂检测痰液和肺泡灌洗液的报阳时间也与MGIT 960培养的结果相差无几，进一步参考陈军等[5]对BACTE MGIT 960、Bac T/ALERT 3D和罗氏固体培养基培养痰标本的报阳时间[分别为(14±7) d，(19±6) d和(26±7) d]的研究结果，发现MGIT 960培养的报阳时间最短，故可以认为改良培养试剂在报阳时间方面不劣于MGIT 960和其他培养试剂。

在痰液标本检测污染率方面，改良试剂法明显高于MGIT 960培养，也高于我国《结核病诊断实验室检验规程》[6]要求的6%。笔者认为有以下原因：首先，可能与改良培养试剂中的杂菌抑制剂组分与MGIT 960试剂中的组分存在差异有关。尽管笔者在配制改良培养试剂时，尽量将营养添加剂和杂菌抑制剂所含成分与MGIT 960培养试剂相一致，但仍可能出现一定的差异，导致其对痰液标本中常见菌群的抑制作用有所差别。其次，也可能与接种操作引起的系统误差有关，即向培养基接种标本悬液时先吸取0.5 ml加入BD管，再吸取0.5 ml加入改良管，有可能将含杂菌较多的沉渣带入到改良管中，增加其污染率[7]。但两种培养基对肺泡灌洗液报告阳性的所有培养管均无污染，这可能与4%NALC处理液和杂菌抑制剂的双重作用可使肺泡灌洗液标本中的杂菌生长受限，降低了污染风险有关；也可能与下呼吸道感染较少、肺泡灌洗液标本采集无菌化有关[8]。这些都提示，可以通过改善操作、接种时减少沉渣带入、改变标本前处理消化液中NaOH浓度[9]来降低污染率。尽管本款改良试剂对痰液标本的高污染率没有降低其阳性检出率，但按照标准操作规程的要求，所有污染标本均需进行重处理，这将会增加试剂成本和日常工作量，延长培养时间。

以MGIT 960培养结果为参照标准，改良试剂法检测的敏感度和特异度均高于90%，说明该方法诊断效能高，且与MGIT 960培养的诊断一致性好，Kappa值为0.905。而在价格方面，国产改良培养试剂有着明显优势，其成本仅约为MGIT 960试剂的60%。这些均为改良培养试剂的广泛应用提供了有力支撑。但目前改良培养试剂尚缺乏对其他类型标本(如组织、脑脊液、胸腹腔积液等)的培养结果，也不明确是否会影响一些以分枝杆菌培养为基础的实验结果，如熔解曲线、GeneXpert MTB/RIF及药物敏感性试验等，这些均有待进一步研究。

综上所述，改良试剂法检测痰液和肺泡灌洗液标本结核分枝杆菌的阳性率及报阳时间与MGIT 960培养无差异，诊断一致性好，且价格较低，可用于结核病患者痰液和肺泡灌洗液标本的培养，但应注意痰液标本检测污染率较高的问题。本研究为单中心研究，比对标本份数有限，且仅分析了痰液和肺泡灌洗液标本的培养结果，可能降低结果的代表性，还需要多中心大样本的研究。