LncRNA H19通过miR-370-3p/RAF1轴对脑胶质瘤T98G细胞增殖侵袭和放疗敏感性的影响及机制

徐 华， 张海萍， 杨 苗， 马 蕾

(1.西安国际医学中心医院， 陕西 西安 710100 2.西安交通大学第一附属医院干部病房， 陕西 西安 710000)

胶质瘤进展迅速，早期转移，是中枢神经系统发生最多的恶性肿瘤之一，占颅内肿瘤的50%以上[1]。根据世界卫生组织的病理生长和扩散速度特征，胶质瘤可分级为I ～ IV级。脑胶质瘤的临床治疗以手术切除加放疗和化疗为主，然而，患者死亡率和复发率很高，预后较差，中位生存时间小于1年[2,3]。因此，了解胶质瘤发生的分子机制和识别早期诊断的生物标志物是非常重要的。长链非编码RNA (Long non-coding RNAs,lncRNAs)是超过200个核苷酸的转录本，并与各种疾病，包括癌症密切相关[4,5]。lncRNA在各种癌症类型中均有异常表达。lncRNA作为肿瘤促进或抑制因子，被认为是癌症诊断的潜在生物标志物[6]。如lncRNA NORAD通过抑制miR-202-5p参与结直肠癌进展[7]。LncRNA HOTTIP通过调控HOXA9调节人胰腺癌的癌症干细胞特性[8]。越来越多的研究发现LncRNA H19参与了各种肿瘤的进展，如lncRNA H19基因变异与中国人群膀胱癌风险相关[9]。在MCF-7乳腺癌细胞中，lncRNA H19介导17β -雌二醇诱导细胞增殖[10]。然而，关于LncRNA H19在胶质瘤增殖、侵袭及其放疗过程中的作用仍不明了。本研究旨在阐明LncRNA H19在胶质瘤细胞发展中的作用，进一步深入探讨其作用机制。

1 资料与方法

1.1主要材料:本研究所使用的45例胶质瘤组织和相应的瘤旁正常组织均取自我院接受脑胶质瘤切除术且未接受放疗和/或化疗的患者，病理检查显示相邻组织为正常脑组织。所有患者术前进行临床分期，并签署知情同意书，经过本院伦理委员会批准。从中国科学院上海细胞库购买脑胶质瘤T98G细胞。DMEM培养基(Dulbecco改良的Eagle培养基)、Lipofectamine 2000转染试剂购自美国Invitrogen公司，青霉素和链霉素购自美国Gibco公司。CCK-8检测试剂盒购自美国Sigama公司。H19小干扰RNA质粒及其对照、过表达H19的质粒及其对照，RAF1小干扰RNA质粒及其过表达质粒均来自北京擎科生物公司。miR-370-3p抑制剂及其miR-370-3p模拟物来自美国Genepharma公司。

1.3细胞转染:H19小干扰RNA质粒及其对照、过表达H19的质粒及其对照、miR-370-3p抑制剂和miR-370-3p模拟物，RAF1小干扰RNA质粒及其过表达质粒均由公司设计及合成。细胞分为①siRNA NC组：T98G细胞转染2μg siRNA NC质粒；H19 siRNA组：T98G细胞转染2μg H19 siRNA质粒；RAF1 siRNA组：T98G细胞转染2μg RAF1 siRNA质粒；②H19 wt+miR-370-3p mimics组：T98G细胞共转染2μg H19 wt质粒和miR-370-3p mimics；mimics NC+H19 wt组：T98G细胞共转染2μg H19 wt质粒和mimics NC；H19 mut+miR-370-3p mimics组：T98G细胞共转染2μg H19 mut质粒和miR-370-3p mimics；mimics NC+H19 mut组：T98G细胞共转染2μg H19 mut质粒和mimics NC；③inhibitor NC组：T98G细胞转染2μg inhibitor NC；miR-370-3p inhibitor组：T98G细胞转染2μg miR-370-3p inhibitor；④pcDNA-3.1(+)+mimics NC组：T98G细胞共转染2μg pcDNA-3.1(+)质粒和mimics NC；pcDNA-H19+mimics NC组：T98G细胞共转染2μg pcDNA-H19质粒和mimics NC；pcDNA-3.1(+)+miR-370-3p mimics组：T98G细胞共转染2μg pcDNA-3.1(+)质粒和miR-370-3p mimics；pcDNA-H19+miR-370-3p mimics组：T98G细胞共转染2μg pcDNA-H19质粒和miR-370-3p mimics；⑤RAF1 wt+miR-370-3p mimics组：T98G细胞共转染2μg RAF1 wt质粒和miR-370-3p mimics；mimics NC+RAF1 wt组：T98G细胞共转染2μg RAF1 wt质粒和mimics NC；RAF1 mut+miR-370-3p mimics组：T98G细胞共转染2μg RAF1 mut质粒和miR-370-3p mimics；mimics NC+RAF1 mut组：T98G细胞共转染2μg RAF1 mut质粒和mimics NC。根据制造商的说明书将质粒利用Lipofectamine 2000转染至密度为70%左右的T98G细胞中，其中一部分T98G细胞转染后参照文献采用不同Gy X射线(0、2、4、6 Gy)垂直照射细胞[11]，采集细胞样品。

1.4T98G细胞增殖能力测定:CCK-8法检测细胞增殖。将处于指数生长期的细胞重悬，以4000个/孔接种到96孔板中，另外一组细胞用6 Gy X射线照射，48h后加入10μL CCK-8溶液，在37℃下孵育4h。用分光光度计读取细胞吸光度值。实验至少重复3次。

1.5双荧光素酶报告基因活性检测:H19序列包含一个假定的miR-370-3p结合位点，被克隆并插入pmirGlO双荧光素酶miRNA靶表达载体以制备H19 wt，结合位点突变的H19序列同样用于制备H19 mut。此外构建RAF1 wt和RAF1 mut载体。T98G细胞使用Lipofectamine 2000将LncRNA H19 wt、LncRNA H19 mut分别与miR-370-3p mimics、mimics NC，RAF1 wt、RAF1 mut分别与miR-370-3p mimics、mimics NC共转染至T98G细胞，荧光素酶活性用双荧光素酶报告检测系统测量。

1.6细胞侵袭实验:为了评估细胞的侵袭情况，转染24h后，将细胞转移到无血清培养基中12h。上Transwell室涂上50 μL的Matrigel，在37℃下孵育30min以形成凝胶。下室加入含有10%胎牛血清的培养基，上室加入细胞悬液。在37℃孵育24 h后，用4%对甲醛固定细胞，并用0.1%结晶紫染色，随机8个视野进行细胞计数。

1.7实时定量PCR (real-time PCR):使用TRIzol试剂从培养细胞或冷冻组织中提取总RNA，根据制造商的说明，用反转录试剂盒进行逆转录。然后，按照标准的定量PCR程序，使用SYBR Green PCR Master Mix 在实时PCR系统中对LncRNA H19、miR-370-3p和RAF1进行定量PCR。所用引物序列见表1。通过GAPDH作为内参进行相对定量，2-△△Ct法分析结果。

1.8流式细胞仪检测细胞凋亡率:将T98G细胞用0.25%胰酶消化后进行离心，按照说明书在细胞中加入流式缓冲液，重悬细胞，加入5μL Annexin V-APC后孵育30 min，再加5μL PI染液,5 min后用流式细胞仪进行细胞凋亡率检测。

表1 引物序列

1.9Western blot:提取总蛋白，通过BCA蛋白分析试剂盒分析蛋白浓度。每个蛋白质样品在SDS-PAGE凝胶上分离15μg，转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。接下来，PVDF膜与10% BSA孵育，然后与一次和二次抗体孵育，最后进行蛋白曝光。

1.10统计学处理:数据采用SPSS17.0软件进行分析，用平均数±标准差表示。组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1下调LncRNA H19抑制T98G细胞增殖及侵袭，增强其放疗敏感性:与瘤旁组织比较，脑胶质瘤组织LncRNA H19 mRNA表达显著升高，有统计学差异(1.23±0.42 vs 3.15±0.29，t=20.58，P=0.0018<0.01)，与0 Gy剂量X射线照射相比，不同剂量(2 Gy、4 Gy、6 Gy)X射线照射T98G细胞后中H19 mRNA表达显著降低，有统计学差异(2Gy：1.72±0.87 vs 0.97±0.13，t=18.94，P=0.0028<0.01；4Gy：1.72±0.87 vs 0.74±0.84，t=23.52，P=0.0018<0.01；6Gy：1.72±0.87 vs 0.35±0.05，t=14.27，P=0.0049<0.01)。与siRNA NC组相比，H19 siRNA组T98G细胞活力显著降低，有统计学差异(62.83±7.54 vs 30.15±4.82，t=22.06，P=0.0020<0.01)，见图1A。与siRNA NC组相比，H19 siRNA组T98G细胞侵袭数目明显减少，有统计学差异(80.56±6.35 vs 42.18±3.27，t=19.76，P=0.0026<0.01)，见图1B-1C。与siRNA NC组相比，siRNA NC+6Gy组细胞活力显著降低，有统计学差异(82.83±7.54 vs 45.23±5.26，t=17.44，P=0.0033<0.01)，与siRNA NC+6Gy组相比，H19 siRNA+6Gy组细胞活力显著降低，有统计学差异(45.23±5.26 vs 30.87±6.24，t=9.091，P=0.0119<0.05)，见图1D。与siRNA NC组相比，siRNA NC+6Gy组细胞凋亡率显著升高，有统计学差异(5.25±1.23 vs 8.92±2.17，t=17.86，P=0.0032<0.01)，与siRNA NC+6Gy组相比，H19 siRNA+6Gy组细胞凋亡率显著升高，有统计学差异(8.92±2.17 vs 14.87±5.26，t=13.12，P=0.0058<0.01)，见图1E-1F。

由上式可知，在一定波长λ时，若气体的吸收系数α和吸收长度l可以测得，则通过测量光强I和I0的比值得到气体浓度C。

图1 LncRNA H19表达下调对T98G细胞增殖及侵袭，增强其放疗敏感性的影响

2.2LncRNA H19与miR-370-3p之间的关系:LncRNA H19 3’UTR和miR-370-3p之间存在结合位点，见图2A。与mimics NC+H19 wt组相比，H19 wt+miR-370-3p mimics组荧光素酶活性显著降低，有统计学差异(1.17±0.52 vs 3.15±0.29，t=21.34，P=0.0016<0.01)；与mimics NC+H19 mut组相比，H19 mut+miR-370-3p mimics组荧光素酶活性无明显变化，无统计学差异(1.34±0.09 vs 1.27±0.42，t=2.020，P=0.1808>0.05)，见图2B。

图2 LncRNA H19与miR-370-3p靶向结合位点的预测与验证

2.3下调miR-370-3p促进T98G细胞的增殖及侵袭，降低其放疗敏感性:与瘤旁组织比较，脑胶质瘤组织miR-370-3p表达显著降低，有统计学差异(1.37±0.51 vs 0.52±0.08，t=30.45，P=0.0011<0.01)，与0 Gy剂量X射线照射相比，不同剂量(2 Gy、4 Gy、6 Gy)X射线照射T98G细胞后中miR-370-3p表达显著升高，有统计学差异(2Gy：1.45±0.82 vs 2.34±0.02，t=13.60，P=0.0054<0.01；4Gy：1.45±0.82 vs2.89±0.93，t=18.01，P=0.0031<0.01；6Gy：1.45±0.82 vs 3.05±1.02，t=18.37，P=0.0030<0.01)。与inhibitor NC组相比，miR-370-3p inhibitor组T98G细胞活力显著升高，有统计学差异(60.35±8.26 vs 81.23±7.28，t=5.347，P=0.0332<0.05)，见图3A。与inhibitor NC组相比，miR-370-3p inhibitor组T98G细胞侵袭数目明显增加，有统计学差异(85.93±8.76 vs 153.48±9.78，t=10.77，P=0.0085<0.01)，见图3B-3C。与inhibitor NC组相比，inhibitor NC+6Gy组细胞活力显著降低，有统计学差异(60.35±8.26 vs 30.65±9.23，t=20.36，P=0.0024<0.01)，与inhibitor NC+6Gy组相比，miR-370-3p inhibitor+6Gy组细胞活力显著升高，有统计学差异(30.65±9.23 vs 58.27±6.27，t=15.94，P=0.0039<0.01)，见图3D。与inhibitor NC组相比，inhibitor NC+6Gy组细胞凋亡率显著升高，有统计学差异(7.37±0.97 vs 16.85±5.68，t=15.07，P=0.0044<0.01)，与inhibitor NC+6Gy组相比，miR-370-3p inhibitor+6Gy组细胞凋亡率显著降低，有统计学差异(16.85±5.68 vs 8.26±4.26，t=12.69，P=0.0062<0.01)，见图3E-3F。

图3 miR-370-3p表达下调对T98G细胞增殖及侵袭，降低其放疗敏感性的影响

2.4上调LncRNA H19通过miR-370-3p促进T98G细胞增殖、侵袭，降低其放疗敏感性:与pcDNA-3.1(+)+mimics NC组相比，pcDNA-H19+mimics NC组T98G细胞活力显著升高，有统计学差异(59.87±7.23 vs 82.56±5.48，t=5.073，P=0.0367<0.05)，细胞侵袭数目显著增加，有统计学差异(78.65±10.23 vs 169.45±12.56，t=18.37，P=0.0030<0.01)；与pcDNA-3.1(+)+mimics NC组相比，pcDNA-3.1(+)+miR-370-3p mimics组细胞活力显著降低，有统计学差异(59.87±7.23±8.76 vs 28.74±6.54，t=18.87，P=0.0028<0.01)，细胞侵袭数目显著减少，有统计学差异(78.65±10.23 vs 32.47±8.45，t=18.43，P=0.0029<0.01)；与pcDNA-3.1(+)+miR-370-3p mimics组相比，pcDNA-H19+miR-370-3p mimics组细胞活力显著升高，有统计学差异(28.74±6.54 vs 60.13±5.68，t=19.70，P=0.0026<0.01)，细胞侵袭数目显著增加，有统计学差异(32.47±8.45 vs 82.37±10.21，t=25.61，P=0.0015<0.01)，见图4A-4C。与pcDNA-3.1(+)+mimics NC+6Gy组相比，pcDNA-H19+mimics NC+6Gy组细胞活力明显上升，有统计学差异(43.27±7.82 vs 68.94±5.47，t=21.39，P=0.0022<0.01)，细胞凋亡率明显降低，有统计学差异(10.26±6.23 vs 5.13±2.04，t=11.08，P=0.0080<0.01)；与pcDNA-3.1(+)+mimics NC+6Gy组相比，pcDNA-3.1(+)+miR-370-3p mimics +6Gy组细胞活力明显降低，有统计学差异(43.27±7.82 vs 22.15±3.27，t=14.27，P=0.0049<0.01)，细胞凋亡率明显上升，有统计学差异(10.26±6.23 vs 18.79±4.35，t=14.92，P=0.0045<0.01)；与pcDNA-3.1(+)+miR-370-3p mimics +6Gy组相比，pcDNA-H19+miR-370-3p mimics +6Gy组细胞活力明显上升，有统计学差异(22.15±3.27 vs 60.93±8.72，t=10.17，P=0.0095<0.01)，细胞凋亡率明显降低，有统计学差异(18.79±4.35 vs 12.36±2.87，t=12.27，P=0.0066<0.01)。

2.5miR-370-3p与RAF1之间的关系:LncRNA H19 3’UTR和miR-370-3p之间存在结合位点，见图5A。与mimics NC+RAF1 wt组相比，RAF1 wt+miR-370-3p mimics组荧光素酶活性显著降低，有统计学差异(1.17±0.52 vs 3.15±0.29，t=21.34，P=0.0016<0.01)；与mimics NC+RAF1 mut组相比，RAF1 mut+miR-370-3p mimics组荧光素酶活性无明显变化，无统计学差异(1.34±0.09 vs 1.27±0.42，t=2.020，P=0.1808>0.05)，见图5B。

2.6下调RAF1抑制T98G细胞增殖及侵袭，增强其放疗敏感性:与癌旁组织比较，脑胶质瘤组织RAF1 mRNA表达显著升高，有统计学差异(1.34±0.51 vs 2.37±0.81，t=22.47，P=0.0020<0.01)，与0 Gy剂量X射线照射相比，不同剂量(2 Gy、4 Gy、6 Gy)X射线照射T98G细胞后中RAF1 mRNA表达显著降低，有统计学差异(2Gy：1.63±0.25 vs 1.04±0.24，t=7.653，P=0.0167<0.05；4Gy：1.63±0.25 vs 0.86±0.24，t=14.52，P=0.0047<0.01；6Gy：1.63±0.25 vs 0.42±0.08，t=31.47，P=0.0010<0.01)。与siRNA NC组相比，RAF1 siRNA组T98G细胞活力显著降低，有统计学差异(58.27±8.92 vs 33.46±5.27，t=25.92，P=0.0015<0.01)，见图6A。与siRNA NC组相比，RAF1 siRNA组T98G细胞侵袭数目明显减少，有统计学差异(79.26±7.54 vs 28.93±6.83，t=22.85，P=0.0019<0.01)，见图6B-6C。与siRNA NC组相比，siRNA NC+6Gy组细胞活力显著降低，有统计学差异(58.56±8.45 vs 40.18±4.76，t=9.214，P=0.0116<0.05)，与siRNA NC+6Gy组相比，RAF1 siRNA+6Gy组细胞活力显著降低，有统计学差异(40.18±4.76 vs 22.36±5.27，t=7.799，P=0.0160<0.05)，见图6D。与siRNA NC组相比，siRNA NC+6Gy组细胞凋亡率显著升高，有统计学差异(5.25±1.23 vs 8.92±2.17，t=17.86，P=0.0032<0.01)，与siRNA NC+6Gy组相比，RAF1 siRNA+6Gy组细胞凋亡率显著升高，有统计学差异(8.92±2.17 vs 18.27±5.59，t=21.22，P=0.0022<0.01)，见图6E-6F。

图4 LncRNA H19通过miR-370-3p对T98G细胞增殖及侵袭，降低其放疗敏感性的影响

图5 miR-370-3p与RAF1靶向关系的预测与验证

图6 RAF1表达下调对T98G细胞增殖及侵袭，增强其放疗敏感性的影响

2.7上调LncRNA H19靶向miR-370-3p调控RAF1表达:与pcDNA-3.1(+)+mimics NC组相比，pcDNA-H19+mimics NC组RAF1 mRNA表达显著升高，有统计学差异(1.32±0.71 vs 2.39±0.42，t=17.03，P=0.0034<0.01)，pcDNA-3.1(+)+miR-370-3p mimics组RAF1 mRNA表达显著降低，有统计学差异(1.32±0.71 vs 0.34±0.04，t=17.58，P=0.0033<0.01)。与pcDNA-3.1(+)+miR-370-3p mimics组相比，pcDNA-H19+miR-370-3p mimics组RAF1 mRNA表达显著升高，有统计学差异(0.34±0.04 vs 1.48±0.26，t=15.36，P=0.0036<0.01)，见图7A。与pcDNA-3.1(+)+mimics NC组相比，pcDNA-H19+mimics NC组RAF1蛋白表达显著升高，有统计学差异(0.93±0.53 vs 1.92±0.08，t=19.53，P=0.0026<0.01)，pcDNA-3.1(+)+miR-370-3p mimics组RAF1蛋白表达显著降低，有统计学差异(0.93±0.53 vs 0.16±0.02，t=18.37，P=0.0030<0.01)。与pcDNA-3.1(+)+miR-370-3p mimics组相比，pcDNA-H19+miR-370-3p mimics组RAF1蛋白表达显著升高，有统计学差异(0.16±0.02 vs 0.87±0.35，t=15.94，P=0.0039<0.01)，见图7B。

图7 LncRNA H19通过miR-370-3p对RAF1表达的影响

3 讨 论

神经胶质瘤是中枢神经系统中最常见的恶性肿瘤。尽管晚期手术和放化疗有效，但晚期胶质瘤患者的5年生存率低于6%。已有研究报道lncRNA H19在肿瘤发生和转移中起着至关重要的作用，Qin等发现lncRNA H19启动子区域的功能多态性与晚期结直肠癌的癌症风险和临床结果有关。还发现LncRNA-H19通过调控miR-124-3p靶向ITGB3调控异位子宫内膜细胞增殖和侵袭[12]。然而，其在胶质瘤组织中的表达及在胶质瘤细胞中的调节机制尚不清楚。在本研究发现lncRNA H19在人脑胶质瘤组织中的表达升高。为了探讨lncRNA H19在胶质瘤进展中的生物学功能，我们进行了体外实验，显示lncRNA H19的下调抑制了胶质瘤细胞的体外增殖和转移，而且还发现下调lncRNA H19表达会使X射线照射的T98G细胞凋亡率升高，提高细胞的放射敏感性揭示了lncRNA H19可能作为胶质瘤治疗的生物标志物和治疗靶点。

lncRNA与miRNAs具有序列互补性，lncRNA可靶向miRNAs调控肿瘤的发展。LncRNA SNHG15通过靶向miR141/PD-L1参与胃癌的免疫逃逸[13]。LncRNA-SNHG6通过靶向miR-6509-5p和HIF1A促进肝癌的发展。在我们的研究中，生物信息分析和荧光素酶报告分析显示，miR-370-3p是胶质瘤细胞中LncRNA H19的潜在靶点。此外，LncRNA H19的上调与胶质瘤组织中miR-370-3p的下调密切相关。在本研究证实了miR-370-3p是LncRNA H19的直接靶点。生物学功能研究表明下调miR-370-3p促进了T98G细胞增殖和侵袭。此外上调LncRNA H19靶向miR-370-3p促进了T98G细胞增殖和侵袭，降低了T98G细胞的放疗敏感性。越来越多的研究表明RAF1参与了各种癌症的发展。如Zhi等发现吉非替尼通过RAF1/ERK通路逆转胰腺癌细胞系的多药耐药[14]。在人类结直肠癌中，抑制RAF1激酶活性恢复根尖基极性并损害肿瘤生长。CircAGFG1通过miR-370-3p/RAF1信号促进宫颈癌进展[15]。在本研究发现miR-370-3p靶向RAF1，下调RAF1表达后抑制了T98G细胞增殖和侵袭，提高了T98G细胞的放疗敏感性，在胶质瘤发展过程中也发挥了重要作用。

总之，在胶质瘤组织和细胞中，lncRNA H19和RAF1表达上调，而miR-370-3p表达下调。我们的研究结果表明，lncRNA H19可以通过结合miR-370-3p，进而上调RAF1的表达，促进胶质瘤细胞的增殖和转移，这可能是胶质瘤治疗的一个很有前景的靶点。