联合检测凝血筛查指标及D-二聚体对新型冠状病毒肺炎患者临床分型的诊断价值

吴迪 范欣欣 沈建山 林友飞 陈晓红 黄明翔 陈力舟

新型冠状病毒肺炎(coronavirus disease 2019，COVID-19)以新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)作为病原体，在世界范围内造成了大规模流行。COVID-19有多种临床表现形式，轻型患者可以仅仅表现为低热、轻微乏力等症状，无明显肺炎的表现；重症患者多在发病7 d后出现呼吸困难和(或)低氧血症，部分病情危重的患者可快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒、凝血功能障碍及多器官功能衰竭等[1]。当COVID-19患者向重症方向进展时，其体内机体凝血机制会失衡，可出现肺血管炎、血栓形成(混合血栓、透明血栓)，乃至危及生命。因此，对危重患者进行早期识别和及时治疗至关重要。

凝血筛查指标包括活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time，APTT)、凝血酶原时间(prothrombin time，PT)、凝血酶时间(thrombin time，TT)、纤维蛋白原(fibrinogen，Fib)，可以反映人体凝血功能的状态[2]。D-二聚体(D-dimer)是交联纤维蛋白的一种降解产物，数值升高表明凝血酶生成增加，纤溶酶对纤维蛋白的溶解增多，进而导致机体容易形成血栓。凝血试验结果的监测可以反映患者临床状态，帮助确定监护水平。Huang等[3]及Chen等[4]研究发现，D-二聚体升高与患者病情严重程度具有相关性。本研究以临床确诊COVID-19患者为研究对象，探讨凝血筛查指标及D-二聚体水平与患者疾病严重程度的关系，及其对患者临床分型的诊断价值。

资料和方法

一、研究对象

回顾性收集2020年1月23日至2月26日在福建省福州肺科医院确诊为COVID-19的72例患者。于住院时、住院期间及疾病出现进展时，检查患者凝血筛查指标及D-二聚体水平，排除凝血筛查指标及D-二聚体标本为非同时检测的标本，或检测项目不全的标本，最终共获得147份检验结果。再根据采血当天患者所处的不同临床分型进一步分组：轻型和普通型作为轻症组(72份)，重型和危重型作为重症组(75份)。本研究经本院伦理委员会批准[批准编号：2020-016(科研)-01]，所有患者资料均为匿名分析。

患者纳入标准：依据《新型冠状病毒肺炎防控方案(第四版)》[1]，纳入符合COVID-19诊断标准的患者。

患者排除标准：排除并发肿瘤、血液系统疾病等影响凝血功能的基础疾病患者。

二、确诊COVID-19患者的临床分型

依据《新型冠状病毒肺炎防控方案(第四版)》[1]，新型冠状病毒肺炎患者临床分型为：(1)轻型：临床症状轻微，影像学未见肺炎表现；(2)普通型：具有发热、呼吸道症状等，影像学可见肺炎表现；(3)重型：成人符合下列任何一条，①出现气促，呼吸频率≥30次/min；②静息状态下，吸空气时指氧饱和度≤93%；③动脉血氧分压(PaO2)/吸氧浓度(FiO2)≤300 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)，临床症状进行性加重，肺部影像学显示24～48 h内病灶明显进展>50%者；(4)危重型：符合以下情况之一者，①出现呼吸衰竭，且需要机械通气；②出现休克；③并发其他器官功能衰竭需通过ICU监护治疗。

三、仪器与试剂

SARS-CoV-2核酸检测仪采用美国赛默飞世尔全自动核酸提取仪，试剂盒由中山大学达安基因股份有限公司提供。凝血指标及D-二聚体水平检测采用沃芬医疗器械商贸有限公司的TOP-750全自动血凝仪及配套试剂。

四、研究方法

1.检测方法：所有患者均采集3 ml静脉血于枸橼酸钠抗凝真空管中，以离心半径17.2 cm，3500 r/min离心10 min，检测血浆APTT、TT、PT、Fib及D-二聚体水平。

2.研究内容：研究凝血筛查指标及D-二聚体水平与患者疾病严重程度的关系，以及多项检测指标单独和联合检测对患者临床分型的诊断价值。

3. 相关定义：(1)联合检测：采用多项诊断试验检测同一受试对象，包括并联试验和串联试验；(2)并联检测：全部试验中，任何一项结果阳性定义为阳性，可以提高检测的敏感度；(3)串联检测：全部试验中，所有结果均为阳性定义为阳性，可以提高检测的特异度[5]。(4)检测指标：敏感度=真阳性例数/(真阳性例数+假阴性例数)×100%；特异度=真阴性例数/(真阴性例数+假阳性例数)×100%；约登指数=敏感度+特异度-1。

五、统计学处理

结 果

一、两组患者血液中D-二聚体及凝血筛查指标的比较

重症组患者D-二聚体及凝血筛查指标TT、PT、Fib水平均明显高于轻症组患者，差异均有统计学意义(P值均<0.05)；而APTT水平在两组间差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 两组患者血液中D-二聚体及凝血筛查指标TT、PT、Fib、APTT水平的比较

二、D-二聚体及凝血筛查指标对诊断COVID-19临床分型的ROC曲线分析

通过绘制ROC曲线进一步分析血浆D-二聚体、TT、PT及Fib对鉴别轻症组和重症组患者的诊断价值。D-二聚体的曲线下面积为0.917(95%CI：0.869～0.964)，明显高于TT、PT、Fib的曲线下面积[分别为0.617(95%CI：0.526～0.709)、0.715(95%CI：0.623～0.799)和0.672(95%CI：0.585～0.759)]；当约登指数取最大值(0.756)时，D-二聚体的临界值为0.364 mg/L，诊断重症组的敏感度为86.7%，特异度为88.9%。见图1。

图1 D-二聚体及凝血筛查指标诊断新型冠状病毒肺炎的ROC曲线

三、D-二聚体及凝血筛查指标对诊断COVID-19患者临床分型的效能

通过D-二聚体和TT、PT、Fib的单独及联合检测，可以发现单用D-二聚体效果(约登指数)最优。当并联D-二聚体和Fib时，约登指数为0.627，低于单用D-二聚体的约登指数，但与单用D-二聚体相比，可以进一步提升敏感度，也具有潜在的临床价值。见表2。

表2 以临床诊断结果为标准评估D-二聚体和凝血筛查指标单独和联合检测对新型冠状病毒肺炎临床分型的诊断效能

讨 论

COVID-19主要通过呼吸道-飞沫在人与人之间进行传播，肺脏是最为常见的受累部位[6]。COVID-19患者的临床表现不一，轻症者可以没有症状，重症者则可发展成危重症，甚至危及生命。目前国际疫情形势严峻，国内也仍间断出现局部地区的病例暴发，仍需始终如一做好常态化疫情防控工作。不同临床分型患者的预后差异巨大。凝血功能筛查与D二聚体水平检测简单、易行，已在基层广泛开展，本研究旨在探究凝血筛查指标和D-二聚体检测结果对COVID-19患者临床分型的诊断价值，以期为COVID-19患者临床分型的快速诊断提供参考。

Th1细胞和细胞毒性T细胞是对抗病毒感染的主要免疫细胞。抗原呈现细胞(antigen presenting cells，APC)产生抗原后，T细胞通过免疫反应杀死病毒感染细胞。病毒在细胞内的增殖触发中性粒细胞和炎症巨噬细胞的激活。免疫反应会引发并产生细胞因子风暴，这些细胞可促进血小板聚集并启动凝血级联，凝血系统功能障碍是病情加重的特征，同时也是不良预后的危险因素。中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular trap，NET)是中性粒细胞释放的一种解聚的染色质，其在COVID-19患者的血栓前状态中起到一定作用[7]。凝血系统与宿主对出血、伤害和病毒等传染性病因入侵的防御响应密切相关。COVID-19患者凝血异常主要表现为高凝状态，其发病机制目前尚未完全明确[8]。宋景春等[9]牵头执笔的《新型冠状病毒肺炎重症患者相关凝血功能障碍诊疗专家共识》也指出，SARS-CoV-2可导致炎性因子大量释放，形成全身炎症反应综合征，微血管系统受到损害，导致凝血系统异常活化，引起肺、肝、心、肾、肾上腺等实质器官细胞坏死，最终导致多器官功能障碍综合征，而在病理学上表现为全身性小血管炎和广泛的微血栓形成。目前认为，SARS-CoV-2与凝血、纤溶系统的相互作用还存在更为复杂的分子机制，需要进一步深入研究。

本研究提示，重症患者D-二聚体及凝血筛查指标中的TT、PT、Fib水平均高于轻症患者，差异均有统计学意义，而APTT水平在两组间的差异无统计学意义，与付忠晓等[10]研究结果相似，但其研究发现轻重症患者之间Fib的差异无统计学意义。朱洁云等[8]发表的荟萃分析提示，轻症与重症COVID-19患者凝血指标比较，差异均有统计学意义。不同研究结果之间的差异可能与样本量的大小、不同研究凝血检查结果的判断及临床分型的差异存在一定的相关性。虽然在凝血功能筛查方面存在争议，但均一致认可D-二聚体对于轻、重症患者分型有很好的鉴别诊断价值。这与笔者在临床工作中的经验相似，COVID-19患者可以出现多种复杂不一的凝血异常，但是多表现为高凝状态。其中，D-二聚体水平升高的发生率最为常见，且与器官功能及炎性因子水平具有一定的相关性。邓国防和雷建平[11]的研究表明，凝血异常激活，与患者疾病严重程度密切相关，是死亡相关的关键因素，并且提示COVID-19患者的D-二聚体水平>1 mg/L与不良预后存在直接关联[12-13]。还有研究提示，COVID-19患者的凝血障碍与疾病的严重程度和死亡率相关[14-15]。

本研究通过绘制ROC曲线进一步分析，当约登指数取最大值(0.756)时，D-二聚体的临界值为0.364 mg/L，诊断重症组的敏感度为86.7%，特异度为88.9%。这种高凝状态原因可能是SARS-CoV-2对血管内皮细胞的直接攻击、细胞因子风暴介导的炎症-凝血级联反应，危重症患者可能因为长期制动而出现血流淤滞。D-二聚体是交联纤维蛋白的一种降解产物，其升高提示凝血酶生成增加和纤溶酶对纤维蛋白的溶解增多，导致高凝状态[16]。病毒和内毒素等有害物质在进入血液后可以激活凝血因子Ⅻ，激活内源凝血系统和纤维化系统，从而导致D-二聚体增加。D-二聚体水平升高与弥散性血管内凝血(disseminated intravascular coagulation，DIC)形成的增加，以及COVID-19患者最终死亡率增加有关[17]。在COVID-19患者中，PT时间的延长与疾病结果相关[18]。纤维蛋白原是肝脏产生的一种糖蛋白，它参与血液凝固过程，是血栓形成的关键因素。Tang等[19]研究提示，在重症COVID-19患者中，PT时间的延长和D-二聚体的增加与DIC有关，71.4%的死亡结局的患者甚至达到了DIC的标准。

通过D-二聚体和TT、PT、Fib的组合检测，可以发现从诊断效能的角度来看，单用D-二聚体的诊断效能最优。当并联D-二聚体和Fib时，约登指数为0.627，低于单用D-二聚体的约登指数，但与单用D-二聚体相比较，可以进一步提升敏感度，有利于更早期筛选可能会发展成重症的高危患者。Wang等[20]研究进一步表明，Fib将是COVID-19患者的潜在临床预测指标，与本研究结论一致。

本研究的创新在于通过凝血指标与D-二聚体的分别检查及联合检测，探究其对于鉴别轻重症COVID-19患者的临床意义。初步提示，COVID-19患者存在一定程度的凝血功能状态异常，并且在轻、重症不同组的患者中存在差异。D-二聚体、凝血筛查指标中的TT、PT、Fib均对COVID-19疾病分型具有较高的诊断价值及临床意义，可辅助临床分级诊疗，且由于其检测手段简便、易行、普及，值得进一步推广和应用。D-二聚体对疾病分型的诊断效能最优，以0.364 mg/L为临界值，诊断重症组的敏感度为86.7%，特异度为88.9%。当通过D-二聚体和Fib进行串联检测时，可以进一步提升敏感度，早期发现高危患者，具有潜在的临床价值。

有研究报道，转铁蛋白是监测COVID-19患者病情进展的候选诊断标志，并可能指导COVID-19患者抗凝药物的使用[21]。不同的指标对COVID-19患者病情的预测及严重程度的鉴别还需要以后继续进行研究。COVID-19患者在入院时应检查与炎症和凝血有关的生物标志物，并在此后进行动态监测，以尽早识别COVID-19相关的凝血疾病，改善预后。

本研究的局限在于纳入研究的患者数量较少，且为回顾性研究，纳入的患者可能存在选择偏倚。另一方面，由于缺乏同一例患者不同分型转归的动态数据，尚无法为临床预后的判断提供参考依据。未来可以开展更多大样本、多中心的研究，并对凝血筛查指标及D-二聚体对于临床转归以及是否需要进行预防性抗血栓治疗等问题做进一步探究。