裸花紫珠乙酸乙酯提取物对结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

范丽颖，赵伟，曾进

西安市中医医院肛肠科，陕西 西安 710000

结肠癌是消化系统较为常见的恶性肿瘤，近年来不健康的饮食模式导致结肠癌的发病率位居恶性肿瘤第4位，病死率位居第5位[1-3]。目前研究发现中药提取物可对抗肿瘤的转移和侵袭[4]。裸花紫珠（Callicarpa nudiflora，CN）提取物可抑制乳腺癌细胞迁移、侵袭能力[5]。CN乙酸乙酯提取物可通过诱导细胞凋亡来发挥抗银屑病的作用[6]，但其提取物对结肠癌的研究还未见报道。10号染色体上缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10，PTEN）在结肠癌组织中下调表达，其表达水平与结肠癌组织的分化程度密切相关[7]，周密等[8]研究证明PTEN基因的沉默能够明显增强结肠癌细胞的增殖和侵袭能力。但目前关于CN乙酸乙酯提取物与PTEN的关系，CN是否通过PTEN在结肠癌中发挥作用尚不清楚。本研究通过分子生物学技术研究CN是否通过调控PTEN的表达影响结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭。

1 材料与方法

1.1 材料人结肠癌细胞株SW480由武汉大学典型培养物保藏中心提供，DMEM高糖培养基、胎牛血清（FBS）来自美国GIBCO公司，二甲基亚砜（DMSO）、四甲基偶氮唑蓝（MTT）来自美国Sigma公司，Trizol来自美国Ambion公司，蛋白酶抑制剂、RIPA裂解液来自罗氏公司，LipofectamineTM2000转染试剂来自美国Invitrogen公司，BCA蛋白检测试剂盒来自碧云天生物技术研究所，慢病毒载体pGCL来自上海吉凯基因有限公司，PTEN、E-cadherin、N-cadherin、Cyclin D1、p21单克隆抗体来自美国CST公司，beta-Actin一抗、辣根过氧化物酶标记二抗（HRP）来自北京博奥森生物技术有限公司。

1.2 CN乙酸乙酯提取物的制备裸花紫珠采自海南，经中国科学院胡安娜植物园华南植物鉴定中心鉴定为CN。其提取物的制备：CN干燥叶4 kg，80%乙醇加热回流3次，提取液过滤合并，减压蒸馏至膏状，冷冻干燥，保存干粉。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞的培养人结肠癌细胞SW480细胞采用含有10%胎牛血清和双抗（青霉素100 U/mL，链霉素100μg/mL）的改良伊格尔（DMEM）高糖培养基在5%CO2、37℃条件培养箱中培养，收集对数生长期细胞。

1.3.2 MTT法检测细胞增殖情况调整人结肠癌细胞SW480细胞浓度为5×103个/mL接种于96孔板中，每孔细胞悬液100μL，在5%CO2、37℃条件培养箱中培养，待细胞贴壁后，对照组加入0.1%二甲基亚砜（DMSO），用药各组加入终浓度为100 mg/mL、150 mg/mL、200 mg/mL的裸花紫珠，每孔设置3个重复，分别于24 h、48 h、72 h进行细胞增殖检测实验；细胞检测时弃去细胞培养基，磷酸盐缓冲液（PBS）清洗细胞，每孔加入50μL噻唑蓝（MTT），室温孵育2 h；然后每孔加入100μL DMSO孵育15 min，采用酶标仪检测490 nm波长处吸光值（OD值）。

1.3.3 Western blot法检测蛋白表达情况不同浓度CN处理的SW480细胞提取提取总蛋白，测定蛋白浓度；SDS-PAGE凝胶电泳跑胶，电泳后将蛋白转至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜；脱脂奶封闭1 h；一抗稀释4℃孵育过夜，洗涤3次；等渗缓冲盐溶液（TBST）稀释二抗孵育1 h，洗涤2次；超敏化学发光试剂（ECL）显影液发光，Image Quant LAS4010凝胶成像仪观察目的蛋白条带，采集图片；以β-Actin为内参计算蛋白灰度值。

1.3.4 载体构建及细胞转染构建si-PTEN质粒，调整细胞浓度，以3×105个细胞/孔接种于6孔板中，CO2培养箱中37℃孵育过夜；当细胞密度达到50%～80%时，准备包装慢病毒，加入无血清培养基孵育6 h，LipofectamineTM2000瞬时转染，转染后4～6 h更换新鲜培养基，荧光显微镜下观察转染效率，获得稳定低表达PTEN的人结肠癌SW480细胞株。后续功能试验中，转染si-NC的细胞系为转染si-PTEN的对照组。

1.3.5 Transwell实验检测结肠癌细胞的迁移和侵袭能力（1）迁移实验：以每孔104个细胞加入Transwells上室，下室加入含有5%血清的DMEM，5%CO2、37℃条件下培养20～24 h；取出Transwells，弃去培养基，PBS清洗2次，棉签擦去Transwells膜上未穿过的细胞，90%乙醇固定10 min，0.1%结晶紫室温染色30 min，PBS清洗2次；计数200倍视野下细胞，随机选5个低倍镜观察，计算穿膜细胞数。（2）侵袭实验：实验前提前将Matrigel胶在冰上解冻，按照1∶2的体积比与无血清DMEM培养基混匀制备Matrigel基质胶；Matrigel基质胶加入Transwells小室，以每孔104个细胞加入Transwells上室，其余操作步骤同迁移实验。

1.4 统计学方法应用SPSS20.0统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 CN乙酸乙酯提取物对结肠癌细胞SW480增殖的影响与对照组比较，48 h、72 h CN乙酸乙酯提取物各剂量组结肠癌细胞SW480的OD值显著降低，且随着浓度的增加细胞活力、Cyclin D1蛋白水平逐渐降低，而p21蛋白水平逐渐升高，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。选择实验最优浓度200 mg/mL进行后续实验，见图1和表1。

表1 CN乙酸乙酯提取物对结肠癌细胞SW480增殖的影响（±s，n=3）

表1 CN乙酸乙酯提取物对结肠癌细胞SW480增殖的影响（±s，n=3）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与CN乙酸乙酯100 mg/L组比较，bP＜0.05；与CN乙酸乙酯150 mg/L组比较，cP＜0.05。

组别对照组CN乙酸乙酯100 mg/L组CN乙酸乙酯150 mg/L组CN乙酸乙酯200 mg/L组F值P值24 h 0.38±0.03 0.38±0.03 0.37±0.03 0.36±0.03 0.406 0.753 48 h 0.88±0.05 0.66±0.06a 0.56±0.05ab 0.44±0.04abc 40.902 0.001 72 h 1.58±0.06 1.23±0.06a 1.03±0.07ab 0.61±0.05abc 134.705 0.001 Cyclin D1 0.63±0.04 0.49±0.03a 0.30±0.02ab 0.13±0.01abc 191.033 0.001 p21 0.31±0.02 0.43±0.03a 0.59±0.05ab 0.83±0.05abc 198.961 0.001 OD值

图1 CN乙酸乙酯提取物对结肠癌细胞SW480增殖蛋白表达的影响

2.2 CN乙酸乙酯提取物对结肠癌细胞SW480迁移、侵袭的影响与对照组比较，CN乙酸乙酯提取物200 mg/mL组结肠癌细胞SW480迁移、侵袭数目减少；E-cadherin蛋白水平增加，N-cadherin蛋白水平降低，差异均具有统计学意义（P＜0.05），见图2和表2。

表2 CN乙酸乙酯提取物对结肠癌细胞SW480迁移、侵袭的影响（±s，n=3）

表2 CN乙酸乙酯提取物对结肠癌细胞SW480迁移、侵袭的影响（±s，n=3）

组别对照组CN乙酸乙酯200 mg/L组t值P值迁移100.00±2.16 48.00±2.00 30.596 0.001侵袭81.00±2.16 39.00±3.00 19.679 0.001 E-cadherin 0.33±0.02 0.72±0.05 12.544 0.001 N-cadherin 0.73±0.06 0.28±0.02 12.324 0.001

图2 CN乙酸乙酯提取物对结肠癌细胞SW480迁移、侵袭及迁移侵袭蛋白表达的影响（×200）

2.3 CN乙酸乙酯提取物对结肠癌细胞SW480中PTEN表达的影响CN乙酸乙酯提取物200 mg/mL组结肠癌细胞SW480中的PTEN蛋白水平为0.75±0.05，明显高于对照组的0.26±0.02，差异有统计学意义（t=15.760，P＜0.05），见图3。

图3 CN乙酸乙酯提取物对结肠癌细胞SW480中PTEN表达的影响

2.4 抑制PTEN能逆转CN乙酸乙酯提取物对结肠癌细胞SW480增殖的抑制作用与CN乙酸乙酯提取物200 mg/mL+si-NC组比较，CN乙酸乙酯提取物200 mg/mL+si-PTEN组细胞活力升高，PTEN、p21蛋白水平降低，Cyclin D1蛋白水平升高，差异均具有统计学意义（P＜0.05），见图4和表3。

表3 抑制PTEN能逆转CN乙酸乙酯提取物对结肠癌细胞SW480增殖的抑制作用（±s，n=3）

表3 抑制PTEN能逆转CN乙酸乙酯提取物对结肠癌细胞SW480增殖的抑制作用（±s，n=3）

组别OD值Cyclin D1p21PTEN 24 h48 h72 h对照组0.38±0.030.88±0.051.58±0.060.63±0.040.31±0.020.24±0.02 CN乙酸乙酯200 mg/L组0.36±0.030.44±0.04a0.61±0.05a0.13±0.01a0.83±0.05a0.76±0.04a CN乙酸乙酯200 mg/L+si-NC组0.36±0.030.47±0.040.65±0.050.15±0.010.81±0.050.78±0.04 CN乙酸乙酯200 mg/L+si-PTEN组0.37±0.030.69±0.06b1.15±0.08b0.46±0.02b0.59±0.04b0.56±0.03b F值0.30654.796168.927324.864100.743167.678 P值0.821 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001

图4 抑制PTEN能逆转CN乙酸乙酯提取物对结肠癌细胞SW480增殖蛋白表达的影响

2.5 抑制PTEN能逆转CN乙酸乙酯提取物对结肠癌细胞SW480迁移、侵袭的抑制作用与CN乙酸乙酯提取物200 mg/mL+si-NC组比较，CN乙酸乙酯提取物200 mg/mL+si-PTEN组迁移、侵袭数目增加，E-cadherin蛋白水平降低，N-cadherin蛋白水平升高，差异均具有统计学意义（P＜0.05），见图5和表4。

表4 抑制PTEN能逆转CN乙酸乙酯提取物对结肠癌细胞SW480迁移、侵袭的抑制作用（±s，n=3）

表4 抑制PTEN能逆转CN乙酸乙酯提取物对结肠癌细胞SW480迁移、侵袭的抑制作用（±s，n=3）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与CN乙酸乙酯200 mg/L+si-NC组比较，bP＜0.05。

组别 迁移 侵袭E-cadherinN-cadherin对照组CN乙酸乙酯200 mg/L组CN乙酸乙酯200 mg/L+si-NC组CN乙酸乙酯200 mg/L+si-PTEN组F值P值100.00±2.16 48.00±1.63a 48.33±1.89 74.33±1.70b 536.984 0.001 81.00±2.16 39.33±2.49a 39.67±2.62 63.67±2.05b 224.024 0.001 0.33±0.02 0.72±0.05a 0.70±0.05 0.51±0.03b 63.810 0.001 0.73±0.06 0.28±0.02a 0.29±0.02 0.59±0.04b 100.317 0.001

图5 抑制PTEN能逆转CN乙酸乙酯提取物对结肠癌细胞SW480迁移、侵袭及迁移、侵袭蛋白表达的影响（×200）

3 讨论

CN属于马鞭草科紫竹属植物，近年来紫竹属植物的抗肿瘤作用受到关注。高秀丽等[9]首先报道，体外实验中紫竹属杜虹花的果实提取物可抑制人喉癌细胞Hep-2的增殖。CN主要化学成分有黄酮类、二萜类、三萜类、酚酸类等[10]，其黄酮类化合物起关键作用，具有抗炎、止血、抑菌、血压调节、提高免疫力、抑制癌症的作用[11]。药理研究表明，CN中的环烯醚萜苷衍生物对宫颈癌Hela细胞和卵巢癌HeyA8细胞具有不同程度的增殖抑制作用[12]。以上的研究结果均说明CN中的黄酮类化合物具有显著的抑癌作用，但其对结肠癌的作用和其抑癌的机制尚不清楚。

本研究结果显示，随着CN乙酸乙酯提取物浓度的增加，结肠癌细胞活力降低，Cyclin D1蛋白水平降低，p21蛋白水平升高。Cyclin D1与CDK4结合形成复合物而正向调控细胞周期从而促进细胞增殖，而p21可抑制Cyclin D1与CDK4结合从而抑制细胞增殖[13]。本研究结果提示CN可抑制结肠癌细胞的增殖。本研究结果显示，CN 200 mg/mL组结肠癌细胞迁移、侵袭数目减少，E-cadherin蛋白水平升高，N-cadherin蛋白水平降低。E-cadherin属于上皮-间质转化（EMT）上皮细胞标志物，当E-cadherin表达下调时具有极性的上皮细胞失去极性转化成间充质细胞从而促使迁移及侵袭发生[14]。N-cadherin属于基质金属蛋白酶家族成员并可降解细胞外基质沉积而促进细胞转移[15]。本研究结果提示CN可抑制结肠癌细胞的侵袭和转移。

PTEN位于10q23.3，是人10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同原基因，属于抑癌基因[16]。PTEN广泛参与细胞的增殖、迁移和侵袭过程，其主要通过调控细胞信号传导途径发挥抑癌作用[17]。本研究结果显示，CN处理后，结肠癌细胞中PTEN表达水平升高，提示CN可促进PTEN的表达，发挥抑癌作用。PTEN在正常大肠组织中表达水平较高，在大肠癌组织中的表达显著降低[18]。食管鳞状细胞癌中PTEN可抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭[19]。敲除小鼠的PTEN基因可诱导肿瘤的发生[20]。进一步研究CN是否通过PTEN发挥抑制增殖、迁移和侵袭作用，结果显示，抑制PTEN的表达可逆转CN对结肠癌细胞SW480的增殖、迁移和侵袭抑制作用。

综上所述，CN可促进PTEN在结肠癌细胞中的表达并抑制结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭，抑制PTEN的表达可逆转CN对结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用。这一结果说明CN可能通过调控PTEN的表达，抑制结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭。